论文摘要
第一部分聚乙二醇（PEG）制备猪组织工程去细胞瓣膜及其脱细胞效率的研究目的探讨PEG法在组织工程瓣膜准备中的应用价值,比较PEG不同处理时间后的去细胞效率和组织保留情况,确定适宜的PEG去细胞方案。方法猪主动脉瓣膜分为去细胞组和正常对照组。对照组取材后仅以磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡;去细胞组用PEG和DNase I处理,按照PEG的处理时间又分为20分钟、35分钟、45分钟三组。处理后样本用苏木精—伊红染色,扫描电镜观察去细胞情况,DNA含量测定核酸去除,计算去细胞百分率;比较不同组的脱细胞效率;测定和比较不同组样本的组织厚度、组织含水量。SDS-PAGE电泳分析组织蛋白处理前后改变情况。结果组织切片观察:对照组瓣膜具有典型的三层结构,各层间均有细胞分布但以纤维层和海绵层为多;PEG处理组,瓣膜仍然具有类似对照组的三层结构,细胞外基质（ECM）结构保存完整,胶原纤维排列整齐,无明显断裂,仍呈波浪状平行排列,结构紧凑,组织无明显水肿。20分钟组与35分钟组可见细胞分布,45分钟组各层未见细胞。DNA含量测定:20分钟组、35分钟组和45分钟组去细胞百分率分别为28.17±9.58%、40.62±7.94%和95.32±3.61%。45分钟组与20分钟组和35分钟组有显著差异而后两组间无显著差异;对照组、20分钟组、35分钟组、45分钟组的组织厚度分别为:0.39±0.05mm、0.41±0.06mm、0.43±0.05mm、0.44±0.07mm;组织含水量分别为:88.37±4.27%、90.81±2.21%、91.47±2.63%、91.89±3.01%。各组组织厚度和组织含水量无显著差异。对照组和45min组蛋白提取物的浓度分别为0.46±0.07 mg/mL和0.15±0.04 mg/mL;SDS-PAGE电泳显示,在蛋白分子量25kDa250kDa范围内,PEG组蛋白条带虽然很细微,但仍然可见。结论PEG处理45分钟法去除细胞完全,细胞外基质保存完整,与对照组比较组织厚度、组织含水量无显著差异;PEG处理能够减少蛋白数量,但对其成分改变不大。45分钟PEG处理可以有效制备猪去细胞瓣。第二部分聚乙二醇制备猪去细胞主动脉瓣膜平面双轴生物力学测定目的验证PEG法在组织工程瓣膜准备中的应用价值,观察猪主动脉瓣叶经PEG处理时间后的生物力学性质,并和天然猪主动脉瓣叶进行比较。方法猪主动脉瓣膜分为PEG组和正常对照组。瓣叶处理方案分别为:对照组,取材后仅以磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡;PEG组,PEG浸泡振摇45分钟和DNase I处理。处理后各组部分样本用苏木精—伊红染色观察去细胞情况,DNA含量测定核酸去除,计算去细胞百分率;部分样本沿瓣叶径向和周向裁减测样,测定组织厚度后用AGS-J电子测试仪行拉伸实验获得最大应力、最大应变、弹性模量和应力—应变曲线。结果组织切片观察:对照组瓣膜具有典型的三层结构,各层间均有细胞分布但以纤维层和海绵层为多;PEG处理组,瓣膜具有三层结构,细胞外基质（ECM）结构保存完整,各层未见细胞。DNA含量测定:PEG组去细胞百分率为94.48±4.32%。正常组、PEG组的瓣叶组织厚度分别为:0.39±0.05mm、0.41±0.05mm,各组组织厚度无显著差异。力学检测,对照组、PEG组都表现出两轴向力学性能不同的各向异性特征,对照组和PEG组具有基本相同的应力—应变曲线。径向两组最大应力、最大应变、弹性模量分别为:2.831±1.036MPa、2.496±1.251MPa;0.387±0.127、0.573±0.143;17.671±0.957 MPa、16.552±1.038 MPa周向两组最大应力、最大应变、弹性模量分别为:5.103±1.078 MPa、4.897±0.989 MPa;0.207±0.059、0.219±0.214;36.854±1.566 MPa、35.741±1.207MPa。结论PEG处理45分钟法去除细胞完全,细胞外基质保存完整,脱细胞瓣叶应力—应变曲线和对照组基本相同,仍具有两轴各向异性特点;两组平面两轴向最大应力、弹性模量和周向最大应变无显著差异,径向最大应变增加。PEG制备去细胞瓣力学性能满足组织工程瓣膜要求。第三部分聚乙二醇（PEG）处理猪主动脉去细胞瓣膜支架的免疫反应性研究目的测定PEG处理后的猪主动脉瓣膜支架的免疫反应活性;并和未经过PEG处理的猪主动脉瓣膜支架进行比较。为PEG瓣膜支架的进一步运用寻找实验依据。方法采用PEG浸泡45min法处理猪主动脉瓣膜,制备去细胞瓣膜支架。选择BALB/C小鼠,采用颈部皮下包埋瓣膜。实验分为对照组和PEG组,对照组为新鲜瓣膜皮下包埋; PEG组为去细胞瓣膜皮下包埋。瓣叶组织统一剪裁为1×1cm2大小,于BALB/C小鼠颈部皮下包埋。各组分别于手术后5d、10d、20d各取小鼠六只处死后,取出皮下瓣膜和小鼠脾脏行HE染色观察组织变化情况;取全血离心后得到血清,行ELISA检测IL-2、IL-10定量分析,了解免疫活性;脾脏组织行RT-PCR检测了解IL-2、IL-10转录翻译活性并半定量分析,两组间比较。结果两组小鼠均无实验期间死亡。HE染色显示对照组免疫炎症反应较PEG组发生时间早、程度重,并且组织结构破坏较重。ELISA结果:两组比较,在不同时间点,对照组的IL-2水平均较PEG组显著增高（p<0.05）;同一组内,IL-2水平成波浪样曲线,5d开始上升,在10d最高,20d较10d下降;而两组比较,在不同时间点,IL-10水平无显著差别（p>0.05）;同一组内,IL-10水平呈逐渐上升的趋势。IL-2以及L-10的RT-PCR结果也呈现出类似ELISA结果的趋势。结论PEG处理后的瓣膜细胞以及细胞膜抗原成分去除完全,皮下植入后免疫炎症程度弱,时间短,组织结够破坏少,并且易于自体细胞长入。适于作为TEHV的理想支架,但其最终植入心脏瓣膜部位后的效果仍需要实验证实。第四部分聚乙二醇（PEG）处理猪主动脉去细胞瓣膜支架细胞黏附效率及不同预处理对黏附率影响的研究目的测定PEG处理后的猪主动脉瓣膜支架的细胞黏附效率;并比较其经过不同预处理后对细胞黏附率影响,为进一步完成瓣膜支架在细胞化寻找实验依据。方法选择昆明白小鼠,采用组织贴块法,原代培养主动脉成纤维细胞,选用5～8代细胞用于细胞黏附率测定。实验分为PEG组、PEG+明胶（gelatin）组、PEG+多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine,PLL）组和PEG+胎牛血（FBS）清组。PEG组为经PEG和DNase I处理的猪主动脉瓣叶;PEG+gelatin组、PEG+PLL组和PEG+FBS组为PEG处理后瓣叶在测定细胞黏附率前,先由相应物质包被瓣叶行预处理。各组瓣叶组织大小统一为1×1cm2,置于24孔板内,每个样本按5×105数量种植细胞,种植1h后,取出玻片和瓣叶组织,培养基洗脱其上未黏附细胞。24孔板进行MTT检测未黏附细胞数量,与总细胞数相减得到黏附细胞数,计算黏附效率并比较。PEG组取出瓣叶组织放入培养瓶静态培养2周,HE染色观察细胞生长和分布情况。结果成功有效培养出小鼠主动脉成纤维细胞; PEG组、PEG+ gelatin组、PEG+ PLL组、PEG+ FBS组的细胞黏附率为:42.63%±5.19%,69.22%±6.63%,65.78%±4.45%,85.32%±3.61%。经过预处理后各组细胞黏附率均显著高于PEG组,其中以胎牛血清效果更加显著。静态培养两周后组织切片观察:瓣叶组织三层结构,细胞生长良好,各层均有细胞分布,表层细胞数量较深部多,可见有形成连续排列的细胞层。结论组织贴块法培养主动脉成纤维细胞方便有效。PEG处理瓣叶可以黏附细胞,处理瓣叶组织经预处理后可以获得更加理想的细胞黏附率。
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