分裂泛素化酵母双杂研究光合膜蛋白相互作用

论文摘要

光合类囊体膜主要由光系统Ⅱ、细胞色素b6f复合物、光系统Ⅰ以及ATP合酶四个超分子复合物组成。为进行光合作用功能基因组学研究,采用分裂泛素化酵母双杂交技术从拟南芥叶片cDNA文库中筛选互作蛋白,以期发现参与光系统Ⅱ组装和功能调控的蛋白因子。本论文为实现这一设想作了一些尝试: 1.利用分裂泛素化酵母双杂交系统研究光合类囊体膜蛋白间的相互作用。将叶绿体psbA基因编码的D1蛋白作为诱饵蛋白,以叶绿体基因psbD编码的D2蛋白、petB编码的Cytb6蛋白作为靶蛋白,分别共转化酵母菌株后进行相互作用分析。实验结果表明,诱饵蛋白D1能与来源于同一复合物光系统Ⅱ的D2蛋白发生相互作用,而与来源于细胞色素b6f复合物的Cytb6蛋白没有互作。这一结果表明,分裂泛素化酵母双杂交系统可以用于检测光合膜蛋白间的相互作用,从而为研究光合膜蛋白生物发生的调控机理提供一个有效的工具。 2.采用Gateway克隆技术构建拟南芥叶片cDNA入门文库（entry library）以attB2-Oligod（T）反转录合成cDNA第一链,在DNA聚合酶Ⅰ作用下合成第二链后,在其5’端引入attB1位点以进行BP重组反应。以反应产物电转化大肠杆菌DH10B。对文库进行质量分析显示该文库代表性为0.97×107,平均插入片段长度684bp,插入片段长度范围500-950bp。

论文目录

• 缩写词 ABBREVIATIONS
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 研究背景
• 1.光合作用功能基因组学研究
• 2.PSⅡ的结构与功能
• 3.酵母双杂交系统在蛋白质相互作用研究中的应用及发展
• 3.1 酵母双杂交的原理
• 3.2 酵母双杂交系统的应用及其局限性
• 3.3 酵母双杂交体系的新发展
• 3.4 分裂泛素化酵母双杂交系统（split-ubiquitin yeast two hybrid）
• 4.cDNA文库及其构建策略
• 5.本论文研究目的及意义
• 第二章 分裂泛素化系统在光合膜蛋白相互作用研究中的可行性
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 融合诱饵蛋白在酵母细胞内的表达
• 2.3.2 表达蛋白可作为功能性诱饵
• 2.3.3 酵母双杂验证光合膜蛋白的特异性相互作用
• 2.3.4 互作蛋白在酵母膜上的定位分析
• 2.4 讨论
• 第三章 CDNA表达文库的构建
• 3.1 引言
• 3.2 文库构建方案及结果
• 3.2.1 Total RNA制备
• 3.2.2 mRNA的分离
• 3.2.3 双链cDNA分子合成
• 3.2.4.双链cDNA分级及定量
• 3.2.5.BP反应
• 3.2.6.电转化entry library
• 3.2.7.Entry文库质量分析
• 3.2.8载体转换
• 3.3.讨论
• 第四章 参考文献
• 在读期间已发表的论文
• 致谢