农业废物好氧堆肥中氨氧化菌的研究

论文摘要

堆肥化用于处理农业废物已经得到了广泛的应用,但由于堆肥化过程中氮素的损失会产生臭气并导致堆肥产品质量的下降,研究堆肥过程中氮素的转移转化规律具有重要的实际意义。氨氧化细菌（ammonia-oxidizing bacteria, AOB）能将氨氧化为亚硝酸盐,是硝化过程的第一步,也是其中的限速步骤,在氮素循环过程中起着重要的作用。在农业废物好氧堆肥过程中以氨氧化细菌为切入点,采用分子生物学的方法研究其群落结构的演替及其与环境因子之间的关系,揭示堆肥中氮素转移与转化规律,可以为优化堆肥工艺,减少氮素损失提供理论指导。本研究利用秸秆等原料对农业废物好氧堆肥过程进行模拟,在堆肥的不同时间进行取样,对堆体温度、pH、含水率、NH4+-N、NO3--N等环境因子进行监测。结果显示,堆肥高温期（>50℃）维持了8天,最高温度达到了55.6℃,满足杀灭动植物病原菌的要求；pH整体在6.59～8.76范围内波动,至堆肥结束时呈碱性,有利于微生物有效的发挥作用。堆肥前期NH4+-N含量波动上升,在第6d达到最大值1628mg·kg1（以干样计）之后含量呈下降趋势；而NO3--N含量在堆肥初期有短期上升,2～12d逐渐下降,整体处于较低水平,而在堆肥中后期逐渐增加,当堆肥结束时,达到552.2mg-kg-1（以干样计）。从各个环境因子来看,实验室模拟农业废物好氧堆肥过程较为成功。应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术对农业废物好氧堆肥过程中氨氧化细菌种群结构随时间的变化情况进行了研究,结果表明,AOB群落的Shannon-Weaver指数初始值为2.58,堆肥结束时为2.02,多样性整体呈下降趋势。通过对部分优势条带进行克隆测序,发现Nitrosospira和Nitrosomonas为堆肥中AOB的优势种属,其中Nitrosomonas存在于整个堆肥过程中,是耐受性较强的种属。使用Canoco4.5软件对获得的氨氧化细菌种群数据与不同时期堆体温度、pH、含水率、NH4+-N、NO3-N等环境因子的相关性进行冗余分析（Redundancy Analysis, RDA）。RDA二维排序图显示堆肥前期样点分布较为集中,后期样点分布较为分散,表明AOB群落结构在堆肥高温期前期（4～9d）变化较小,而在高温期后期（9～12d）特别是降温期（12～25d）演替尤为剧烈。基于手动选择的RDA分析结果表明,堆体温度、NH4+-N和N03-N对AOB群落演替有着显著的影响（p<0.05）,且前2个因子达到了极显著水平（p<0.01）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 插图索引
• 附表索引
• 第1章 绪论
• 1.1 农业废物概述
• 1.2 堆肥化
• 1.2.1 堆肥化原理
• 1.2.2 堆肥化的基本工序
• 1.2.3 影响堆肥的因素
• 1.2.4 堆肥化处理农业废物存在的问题
• 1.3 氨氧化菌的研究进展
• 1.3.1 氨氧化菌与氮素循环
• 1.3.2 氨氧化菌的种类
• 1.3.3 影响氨氧化菌的环境因子
• 1.4 PCR-DGGE技术在堆肥微生物研究中的应用
• 1.4.1 PCR技术
• 1.4.2 DGGE技术
• 1.4.3 PCR-DGGE技术用于微生物群落多样性分析
• 1.4.4 PCR-DGGE技术用于微生物群落动态研究
• 1.5 多元分析方法
• 1.5.1 排序分析
• 1.5.2 主成分分析（PCA）
• 1.5.3 冗余分析（RDA）
• 1.5.4 除趋势对应分析（DCA）
• 1.5.5 典范对应分析（CCA）
• 1.6 本研究课题意义及内容
• 第2章 农业废物好氧堆肥过程的模拟
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 堆肥材料与处理
• 2.1.2 实验仪器及设备
• 2.1.3 实验器皿及试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 取样方法
• 2.2.2 理化参数测定方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 堆体温度与pH
• 2.3.2 环境温度与含水率
• 4⁺-N与NO₃^-N'>2.3.3 NH₄⁺-N与NO₃^-N
• 2.4 小结
• 第3章 农业废物好氧堆肥过程中氨氧化菌群落结构的研究
• 3.1 仪器设备
• 3.2 主要试剂及其配比
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 堆肥样品的预处理
• 3.3.2 堆肥样品DNA提取
• 3.3.3 DNA的纯化
• 3.3.4 琼脂糖凝胶电泳检验
• 3.3.5 PCR-DGGE
• 3.3.6 切胶测序
• 3.4 数据处理
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 堆肥总DNA提取结果
• 3.5.2 PCR产物检验
• 3.5.3 DGGE指纹图谱分析
• 3.5.4 优势条带分析
• 3.6 小结
• 第4章 环境因子与氨氧化菌群落结构相关性分析
• 4.1 数据分析软件
• 4.2 数据处理方法
• 4.3 冗余分析
• 4.3.1 基于环境因子的RDA分析
• 4.3.2 基于手动选择的RDA
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A （攻读硕士学位期间所发表的学术论文目录）
• 附件