马鹿茸血酶解肽免疫活性及抗氧化活性的研究

论文摘要

鹿茸血是指加工排血茸时由鲜鹿茸中取出的血液成分。本论文对酶解马鹿茸血制备免疫活性肽的条件进行了优化,并对水解物进行了分离纯化;通过体外、体内试验研究了鹿茸血原血及由木瓜酶水解得到的两种肽对小鼠免疫功能及抗氧化功能的影响。选用木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶在最适条件下对马鹿茸血水解,以水解度（DH）以及水解物对·OH和DPPH·的清除率为指标,确定木瓜蛋白酶作为本次试验水解用酶。确定木瓜蛋白酶水解度最高的水解条件为温度52℃、pH为7.4、酶用量（E/S）为12690 U/g底物、[S]为8%,在该条件下水解得到水解肽Ⅰ水解度为18.1%;清除·OH最高的水解条件温度52℃、pH为7.0、酶用量（E/S）为11269 U/g底物、[S]为10%,该条件下得到的水解肽Ⅱ水解度为12.2%,·OH清除率为51.3%;与原血相比,水解肽Ⅰ和水解肽Ⅱ表现出更高的抗氧化活性。采用HPLC测得马鹿茸血水解物中以相对分子质量小于1000的小肽居多。对鹿茸血及其水解肽Ⅰ和水解肽Ⅱ进行体外活性检测试验,结果表明水解肽Ⅱ能显著刺激脾淋巴细胞增殖,对·OH和DPPH·有较高的清除作用（P<0.05）。然后,以鹿茸血及其水解肽Ⅰ和水解肽Ⅱ为受试样品,对小鼠进行动物试验。动物试验表明鹿茸血水解肽Ⅱ组能极显著提高小鼠体液免疫和细胞免疫功能（P<0.01）,同时,能显著增强小鼠的总抗氧化能力和SOD活性、降低丙二醛含量（P<0.05-0.01）,在防止脂质过氧化减轻组织细胞的损伤等具有重要作用。马鹿茸血及其酶解肽抗氧化性与免疫性相关性分析结果显示,具有较强抗氧化活性的肽同时显示出很强的免疫活性,相关系数r=0.87,（P<0.05）。采用732阳离子交换树脂对马鹿茸血水解肽Ⅱ进行初步分离,得到a、b、c、d四个组分。用大孔吸附树脂对四个组分脱盐处理后,通过抗氧化活性及免疫活性测定,组分a对·OH和DPPH·清除效果较好,并且刺激小鼠脾淋巴细胞增殖效果显著（P<0.05）。对组分a采用Sephadex G-15做进一步分离纯化,得到四个洗脱峰,经抗氧化和脾淋巴细胞增殖活性测定显示,第二和第四个洗脱峰表现出较高的活性（P<0.05）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 鹿茸血概述
• 1.1.1 鹿茸血的成分与营养价值
• 1.1.2 鹿血液的研究现状
• 1.2 动物血液蛋白酶解工艺的研究现状
• 1.3 免疫活性肽和抗氧化肽的研究现状
• 1.3.1 常见免疫和抗氧化活性肽概述
• 1.3.2 免疫和抗氧化活性肽的制备方法
• 1.4 研究目的和意义
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究意义
• 1.4.3 研究内容
• 第二章 酶水解马鹿茸血制备活性肽
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料与主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 鹿茸血水解方法
• 2.3.2 鹿茸血液中蛋白含量测定
• 2.3.3 酶活测定
• 2.3.4 水解度的测定
• 2.3.5 水解物相对分子质量分布测定
• 2.3.6 水解物氨基酸组成分析
• 2.3.7 抗氧化能力测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 鹿茸血中蛋白含量
• 2.4.2 不同酶水解马鹿茸血的比较研究
• 2.4.3 木瓜蛋白酶水解鹿茸血工艺条件的确定
• 2.4.4 水解物相对分子质量分布测定
• 2.4.5 水解物氨基酸组成分析
• 2.5 本章小结
• 第三章 马鹿茸血酶解肽体内外免疫功能及抗氧化性的研究
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 材料与主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 实验动物
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 水解肽体外刺激脾淋巴细胞增殖实验
• 3.3.2 动物实验分组和给药设计
• 3.3.3 免疫器官脏器指数测定
• 3.3.4 抗体生成细胞含量测定
• 3.3.5 血清中溶血素含量测定
• 3.3.6 小鼠淋巴细胞体外自增殖反应
• 3.3.7 小鼠血清总抗氧化能力和MDA 含量测定
• 3.3.8 小鼠血清SOD 活力测定
• 3.3.9 统计学分析
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 马鹿茸血木瓜蛋白酶水解肽对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
• 3.4.2 马鹿茸血及其酶解肽对小鼠免疫器官重量的影响
• 3.4.3 马鹿茸血及其酶解肽对小鼠溶血素及抗体生成细胞的影响
• 3.4.4 马鹿茸血及其酶解肽对小鼠淋巴细胞增殖的影响
• 3.4.5 小鼠血清总抗氧化能力、SOD 活力和MDA 含量测定
• 3.4.6 马鹿茸血及其酶解肽抗氧化性与免疫性相关性分析
• 3.5 本章小结
• 第四章 马鹿茸血免疫活性肽的分离纯化
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 材料与主要试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 732 型阳离子交换树脂分离马鹿茸血水解得到的免疫活性肽
• 4.3.2 DA101-C 大孔吸附树脂对经过离子交换层析分离的组分a 动态吸附脱盐
• 4.3.3 DA101-C 大孔吸附树脂脱盐率的测定
• 4.3.4 马鹿茸血水解肽经离子交换层析分离后各组分免疫及抗氧化活性的测定
• 4.3.5 Sephadex G-15 凝胶过滤层析分离组分a
• 4.3.6 组分a 经Sephadex G-15 凝胶过滤层析分离后各组分免疫及抗氧化活性的测定
• 4.4 实验结果与讨论
• 4.4.1 732 阳离子交换树脂分离马鹿血肽
• 4.4.2 DA101-C 大孔吸附树脂对经过离子交换层析分离的组分动态吸附脱盐试验
• 4.4.3 脱盐后各分离组分免疫活性及抗氧化活性鉴定
• 4.4.4 Sephadex G-15 凝胶过滤层析分离组分a
• 4.4.5 经过Sephadex G-15 凝胶过滤层析分离所得分离物活性鉴定
• 4.5 本章小结
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文