RNA干扰Ku70基因对宫颈癌Hela细胞放射敏感性影响的实验研究

论文摘要

宫颈癌的发病率、死亡率占妇科恶性肿瘤第一位。放射治疗是主要治疗手段之一。宫颈癌对放射治疗的敏感性直接影响其疗效与预后。放射线主要是通过导致DNA双链断裂（DNA double-strand break, DSB）起到杀死肿瘤细胞的作用。但细胞具有较高程度的DSB修复能力,修复方式有两种:以DNA依赖蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase, DNA-PK,包括Ku80/ Ku70异二聚体和DNA-PK催化亚单位DNA-PKCs）为主的非同源性末端连接（DNA nonhomologous end-joining, NHEJ）和以ATM （ataxia-telangiectasia mutated）为主的同源重组（homologous recombination）修复。Ku蛋白能与DNA末端及DNA损伤导致的双链DNA断裂（DSBs）末端结合。Ku蛋白是重组修复系统中最重要的组成部分,在DSBs的同源性末端连接和非同源性末端连接修复途径中发挥重要作用,尤以NHEJ为著。Ku蛋白广泛存在于哺乳动物细胞内,最初在多肌炎硬皮病重叠综合征病人体内作为自身抗原被发现,它是由70kDa和80kDa两条多肽链组成,分别被称之为Ku70和Ku80。Ku70亚单位由609个氨基酸组成,分子量约69581Da,Ku80包括732个氨基酸,分子量约81914Da。两个亚单位都有类似亮氨酸拉链结构序列的亮氨酸或亮氨酸-色氨酸周期性重复,这种拉链结构被认为是DNA连接蛋白家族的标志,参与DNA转录调节。Ku异二聚体是参与DNA DSB修复中非同源末端连接途径（NHEJ）的关键酶DNA-PK的催化亚基,在DNA DSB修复和v（D）J重组中起关键作用,编码Ku异二聚体的Ku基因是人鼠同源基因。二聚体之一的Ku70与细胞的电离辐射敏感性、化学药物敏感性、某些肿瘤的发生与进展、细胞凋亡以及衰老均有关系。动物实验研究发现:Ku70蛋白在DSB修复、免疫球蛋白v（D）J重组、DNA复制、转录、热休克反应和端粒体末端精确结构调节等过程中均发挥重要作用。近年来对Ku70蛋白的基因结构和多种功能研究取得新进展,尤其是Ku70蛋白的活性与肿瘤的发生发展相关引起人们的极大关注。本研究采用RNA干扰（RNAi）技术抑制Hela细胞中Ku70蛋白的表达,观察Ku70蛋白表达下调对Hela细胞放射敏感性的影响。实验结果表明,宫颈癌Hela细胞对1.04.0Gyγ射线照射不够敏感,有相当高的辐射抗性。量效实验证实,1.06.0Gyγ射线照射后,HeLa细胞中Ku70 mRNA及Ku70蛋白表达均明显增高。时效实验证实,4.0Gyγ射线照射后8 h72 h,HeLa细胞中Ku70 mRNA及Ku70蛋白表达均明显增高。本实验成功的构建了Ku70基因RNA干扰载体pSilencer-4.1-Ku70,稳定转染HeLa细胞后,有效抑制Ku70蛋白的表达。稳定转染pSilencer-4.1-Ku70干扰质粒并抑制Ku70蛋白表达后,HeLa细胞对γ射线照射的放射敏感性显著增高（P<0.001）。本文所得结果将为宫颈癌的基因治疗及放射治疗提供新的实验依据。具有重要的理论意义及潜在的应用价值。Ku70基因有望作为宫颈癌基因治疗的新靶点。

论文目录

• 提要
• 英文缩写
• 第1章 绪论
• 1.1 Ku70 的来源
• 1.2 Ku70 的结构
• 1.3 Ku70 蛋白的功能
• 1.3.1 Ku 蛋白在DNA 损伤修复中的作用
• 1.3.2 Ku70 参与DNA 复制调控
• 1.3.3 Ku70 参与免疫球蛋白和T 细胞表面抗原受体V（D）J 重组
• 1.3.4 Ku70 作为转录因子调节某些基因的表达
• 1.3.5 Ku70 与RecQ 家族某些成员相互作用而参与核酸代谢过程
• 1.3.6 Ku70 在维持染色体端粒结构中的作用
• 1.3.7 Ku70 可能参与某些细胞的信号转导通路
• 1.4 Ku 蛋白其它生物学功能
• 1.5 Ku 蛋白与端粒
• 1.6 Ku 蛋白与细胞凋亡
• 1.7 Ku 蛋白与肿瘤
• 1.7.1 Ku 基因表达与肿瘤相关研究
• 1.7.2 Ku 蛋白变异体与肿瘤相关研究
• 1.7.3 Ku 蛋白与肿瘤治疗敏感性关系的研究
• 1.8 RNAi 技术及其应用
• 1.8.1 RNAi 的发现和发展
• 1.8.2 RNAi 的作用机制
• 1.8.3 RNAi 的重要特征
• 1.8.4 RNA 干扰载体及导入方法研究
• 1.8.5 RNAi 的作用原理
• 1.8.6 RNAi 在哺乳动物细胞中的应用
• 1.8.7 RNAi 在基因功能研究中的应用
• 1.8.8 RNAi 在疾病治疗中的应用
• 第2章 γ射线照射对Ku70 在HELA 细胞中表达的影响
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 细胞株
• 2.1.4 Ku70 基因的实时荧光定量 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 实时荧光定量 PCR 引物扩增效果的检测
• 2.2.3 Hela 细胞对γ射线的敏感性检测
• 2.2.4 Ku70 在Hela 细胞受到不同剂量γ射线照射后表达水平的检测
• 2.2.5 Ku70 在Hela 细胞受4.0Gy γ射线照射后不同时间表达水平的检测
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 总RNA 的提取
• 2.3.2 实时荧光定量 PCR 引物扩增效果的分析
• 2.3.3 Hela 细胞对不同剂量γ射线照射的辐射效应
• 2.3.4 Ku70 在Hela 细胞受不同剂量γ射线照射后表达水平的变化
• 2.3.5 Ku70 在Hela 细胞受4.0Gy γ射线照射后不同时间表达水平的变化
• 2.4 小结
• 第3章 Ku70 基因RNA 干扰载体的构建及干扰效果测定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 shRNA 表达载体
• 3.2 针对Ku70 基因SIRNA 的设计及合成
• 3.2.1 Ku70 基因的可选择性剪切分析
• 3.2.2 Ku70 基因的局部高级结构分析
• 3.2.3 Ku70 基因的siRNA 设计
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 细胞培养
• 3.3.2 siRNA 转染Hela 细胞
• 3.3.3 shRNA 表达载体的构建
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 siRNA 抑制Hela 细胞Ku70 表达
• 3.4.2 重组pSilencer-4.1-Ku70 质粒的PCR 验证
• 3.4.3 重组pSilencer-4.1-Ku70 质粒的测序结果
• 3.4.4 潮霉素B 对Hela 细胞的杀死曲线（killing curve）
• 3.4.5 pSilencer-4.1-Ku70 质粒转染Hela 细胞后Ku70 表达量分析
• 3.5 小结
• 第4章 RNA 干扰Ku 70 基因对HELA 细胞放射敏感性的影响
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 细胞培养
• 4.2.2 稳定转染干扰质粒后Hela 细胞对γ射线的敏感性检测
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 RNA 干扰Ku70 基因后Hela 细胞放射敏感性的变化
• 4.4 小结
• 第5章 讨论
• 第6章 结论
• 参考文献
• 攻博期间发表的学术论文及其他成果
• 个人简历
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT