IBRV XA株的分离鉴定及其gD蛋白的原核表达

论文摘要

传染性牛鼻气管炎病（ Infectious bovine rhinotracheitis, IBR）是由牛疱疹病毒1型（BHV 1）引起的急性、热性、接触性传染病,主要牛的引起严重呼吸道和生殖道感染,给全球养牛业造成巨大的经济损失,国际兽医局（OIE）将本病列为B类疾病,也是我国进境动物必检疾病之一。BHV-1基因编码11种糖蛋白,主要糖蛋白gB和gD高度保守,是病毒的吸附、穿入和在细胞之间扩散病毒必需的,均能诱导产生较高水平的体液和细胞免疫,尤其gD能够引起比gB更强而持久的细胞免疫,而且gD基因可引起外周血单核细胞和牛淋巴细胞的凋亡,可促成感染牛免疫抑制。基于此,本实验进行了如下三个方面的研究工作。1牛传染性鼻气管炎病毒XA株的分离与鉴定用MDBK细胞从陕西发病奶牛鼻拭子中分离牛传染性鼻气管炎病毒;使用IBR标准阳性血清对该病毒分离物进行中和试验;应用primer 5.0软件设计,根据Genbank公布IBRV的基因组序列,利用gB保守序列设计1对引物,对分离病毒进行PCR扩增,并测序。结果表明:分离病毒在MDBK细胞上产生明显的特征性细胞病变（CPE）:细胞圆缩,聚集成葡萄串样群落,在单层细胞上形成空洞,有几个细胞核的巨大细胞;用标准抗IBRV特异性抗血清能完全中和分离株;用IBRV gB特异性引物进行PCR,可扩增出1182bp的特异性条带,目的序列与发表的IBRV的基因组序列一致。证明该分离株为牛传染性鼻气管炎病毒,命名为IBRV XA株。2牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立及应用参考GenBank中收录的IBRV gB基因序列,应用Primer5.0软件设计了一对引物,扩增目的片段为1182bp。同时对IBRV PCR检测方法进行了特异性、敏感性试验,并应用其对临床疑似发病牛血清及国内部分厂家生产的细胞培养用牛血清进行了检测。结果表明,该方法不仅具有较高的特异性,而且可检测出103.4TCID50/0.1mL的病毒量,病毒DNA最低检出量相当于2.16ng/20ul。98份样品中共检出12份阳性,阳性率为12.2%,其中陕西省不同地区牛场血清样品阳性率为12.8%（11/86）,国内部分厂家生产的血清阳性率为8.3%（1/12）。说明该方法可用于IBRV的临床检测及流行病学监测。3牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的原核表达参考GenBank中收录的IBRV gD基因序列,应用Primer5.0软件设计引物,用PCR方法成功扩增IBRV gD全基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a（+）中,构建了gD基因的原核重组表达质粒pET-32a-gD。原核重组表达质粒pET-32a-gD转化大肠杆菌BL21（DE3）,在异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达gD蛋白,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物表明,表达产物具有与IBRV相同的抗原性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 牛传染性鼻气管炎研究进展
• 1.1 引言
• 1.2 历史沿革及分布
• 1.3 病原学
• 1.3.1 分类
• 1.3.2 形态学
• 1.3.3 病毒复制
• 1.3.4 抗原性
• 1.3.5 血凝性
• 1.3.6 IBRV 分子生物学特性
• 1.3.7 对理化因素的抵抗力
• 1.4 发病机理和流行病学
• 1.4.1 发病机理
• 1.4.2 自然和实验宿主
• 1.4.3 传播和带毒者
• 1.4.4 传播途径
• 1.4.5 潜伏期
• 1.4.6 症状
• 1.4.7 病理组织学
• 1.5 诊断
• 1.5.1 临床综合诊断
• 1.5.2 病毒分离与鉴定
• 1.5.3 特异性检测
• 1.5.4 分子生物学诊断方法
• 1.6 预防与控制
• 1.6.1 传统的活苗
• 1.6.2 传统的灭活苗
• 1.6.3 基因工程疫苗
• 1.6.4 IBRV 根除的前景
• 试验研究
• 第二章 牛传染性鼻气管炎病毒XA 株的分离与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 病料和细胞
• 2.1.2 毒种与血清
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 病料的处理
• 2.1.5 病毒的分离
• 2.1.6 分离毒株毒价的检测
• 2.1.7 病毒中和试验
• 2.1.8 PCR 检测
• 2.1.9 目的基因克隆及鉴定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 病毒分离
• 2.2.2 病毒滴度的测定
• 2.2.3 中和试验
• 2.2.4 PCR 鉴定
• 2.2.5 目的基因的克隆与鉴定
• 2.2.6 目的基因测序
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 牛传染性鼻气管炎病毒PCR 检测方法的建立及应用
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 毒株
• 3.1.2 MDBK 细胞
• 3.1.3 待检血清样品
• 3.1.4 主要试剂
• 3.1.5 引物设计与合成
• 3.1.6 病毒增殖及效价测定
• 3.1.7 病毒 DNA 提取
• 3.1.8 RNA 模板的制备及反转录
• 3.1.9 PCR 扩增及鉴定
• 3.1.10 目的基因克隆及鉴定
• 3.1.11 特异性试验
• 3.1.12 敏感性试验
• 3.1.13 初步应用
• 3.2 结果
• 3.2.1 PCR 扩增及鉴定
• 3.2.2 PCR 特异性试验
• 3.2.3 敏感性试验
• 3.2.4 PCR 初步应用
• 3.3 讨论
• 3.3.1 检测引物设计与检验
• 3.3.2 方法的特异性、敏感性验证
• 3.3.3 方法的实用性
• 3.4 小结
• 第四章 牛传染性鼻气管炎病毒gD 蛋白的原核表达
• 4.1 材料
• 4.1.1 病毒
• 4.1.2 细胞及菌株
• 4.1.3 主要试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 病毒增殖及效价测定
• 4.2.2 PCR 引物的设计与合成
• 4.2.3 病毒 DNA 的提取及 PCR 扩增
• 4.2.4 gD 基因的纯化及克隆鉴定
• 4.2.5 gD 基因原核表达载体的构建
• 4.2.6 重组gD 基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 4.2.7 gD 原核表达产物的 SDS-PAGE 及 Western-blotting 分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 gD 基因的 PCR 扩增
• 4.3.2 gD 基因的克隆
• 4.3.3 gD 基因原核质粒的酶切鉴定
• 4.3.4 gD 基因大肠杆菌表达产物的 SDS-PAGE 分析
• 4.3.5 重组质粒pET-32a-gD 原核表达产物的Western - blotting 分析结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 英文缩略词及中英文对照
• 致谢
• 作者简介