细菌叶绿素的化学修饰及其PDT性能研究

论文摘要

光动力治疗（photodynamic therapy,PDT）被认为是自20世纪80年代以来在癌症治疗中最具前景的一种新方法。光敏剂是光动力治疗的核心物质,光动力疗法的提出、发展及应用都是随着光敏剂的发展而逐渐完善的。目前,光敏剂还存在着一些缺陷和问题,制约着PDT的应用。光敏剂治疗后,还存有光敏副反应,需要一定的避光时间,其吸收波长＜700 nm,组织穿透深度受限,而PDT治疗深部病变或瘤体较大的肿瘤需要具有在红外/近红外光区长波长吸收的光敏剂。本论文选择光合细菌中的细菌叶绿素a作为前体,目的在于研究具有在红外/近红外光区长波长吸收的稳定的金属细菌叶绿素a及细菌叶绿素a的衍生物的合成方法,作为潜在的光敏剂。（1）采用紫外可见光谱,高效液相色谱结合薄层色谱作为分析手段,得到细菌叶绿素a提取分离的有效方法:用甲醇从光合细菌菌体中直接提取,二氧六环蒸馏水沉淀,经硅胶和Sephadex LH-20柱层析分离。（2）采用紫外可见光谱,原子吸收法,红外光谱结合核磁共振谱作为分析和表征手段,对锌细菌叶绿素a的合成方法进行了优化,并对其结构进行了表征,从而扩展到金属细菌叶绿素a类的合成方法:二氯甲烷/甲醇溶液（1/1,v/v）作为反应溶剂,按摩尔比1/80的比例加入脱镁细菌叶绿素a和醋酸盐,加热,充氮气回流反应3h。反应结束后,经硅胶层析柱分离。结果表明,这类化合物吸收波长可达到770 nm左右,有效完善了现有光敏剂的不足。（3）通过紫外可见光谱结合核磁共振谱监测分析,得到细菌叶绿素a的环酐类化合物细菌红紫素a丙酯的合成分离方法,并对产物结构进行了表征。细菌红紫素a丙酯的吸收波长可达到813 nm,而目前临床试用的红紫素类光敏剂,多在650～700 nm处有一强吸收峰,吸收波长明显红移。（4）通过紫外可见光谱结合核磁共振谱监测分析,得到细菌叶绿素a的N-环酰胺化合物的合成分离方法,并对产物结构进行了表征,其吸收波长可达到822nm。（5）Zn-BPhe a对HL-60细胞的PDT处理中分别加入羟基自由基（HR）相对特异性的淬灭剂甘露醇（D-Mannitol,OM）和单线态氧（1O2）相对特异性的淬灭剂叠氮钠（Sodium azide,SA）,以淬灭Ⅰ型反应和Ⅱ型光动力反应所产生的相应活性氧分子（ROS）,并通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法结合Annexin V和PI双染流式细胞仪的检测结果,研究Zn-BPhe a的光动力反应及其对HL-60细胞死亡方式的影响。实验结果表明:Zn-BPhe a对HL-60细胞的光动力反应可能以Ⅱ型为主,光动力反应所产生的1O2以导致细胞坏死为主,HR以导致细胞凋亡为主。（6）通过测定光动力治疗前后,HL-60细胞存活率,膜抗氧化酶活性,膜流动性及膜封闭度的变化,研究PDT对HL-60细胞膜功能的影响,对Zn-BPhe a的PDT致细胞死亡机理进行探讨。采用MTT比色法测定细胞的活性,试剂盒测定Na+,K+- ATP酶活性及丙二醛MDA含量,荧光偏振法测定细胞膜流动性。结果表明,HL-60细胞在进行PDT后,细胞的存活率明显降低,同时Na+,K+-ATP酶活性降低,MDA含量升高,荧光偏振度增大,微粘度升高,细胞膜流动性降低,以上细胞膜功能的变化是HL-60细胞损伤的重要信号,同时说明细胞膜是锌菌绿素a光动力反应的重要部位。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1.1 光动力治疗的概念与作用机理
• 1.2 光敏剂的研究进展
• 1.3 细菌叶绿素的选择优势
• 1.4 卟啉类化合物的特性及金属卟啉化合物的合成
• 1.4.1 卟啉的结构特点
• 1.4.2 金属卟啉配合物的合成
• 1.4.3 卟啉及金属卟啉化合物的性质
• 1.5 课题组前期工作总结
• 1.5.1 金属菌绿素的光谱分析及光动力作用研究
• 1.5.2 锌菌绿素的光动力反应研究
• 1.5.3 锌菌绿素在正常小鼠组织中的分布及抗肿瘤作用的研究
• 1.6 本论文的理论依据及其主要工作
• 第二章 锌细菌叶绿素的合成反应
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要试剂及仪器
• 2.2.3 光合细菌培养基
• 2.2.4 细菌叶绿素BChl a的提取方法
• 2.2.5 细菌叶绿素BChl a的分离纯化方法
• 2.2.6 脱镁细菌叶绿素（Bacteriopheophytin a,BPhe a）的制备方法
• 2.2.7 锌细菌叶绿素Zn-BPhe a的合成方法
• 2.2.8 细菌叶绿素BChl a的测定方法
• 2.2.9 锌细菌叶绿素Zn-BPhe a的测定方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 BChl a的分离结果
• 2.3.2 BChl a、BPhe a、Zn-BPhe a的NMR谱图分析
• 2.3.3 Zn-BPhe a和BPhe a的紫外可见光谱图分析
• 2.3.4 Zn-BPhe a的原子吸收法测定结果
• 2.3.5 Zn-BPhe a和BPhe a的红外光谱图分析
• 2.4 讨论
• 第三章 细菌叶绿素的侧链反应
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 主要试剂及仪器
• 3.2.3 BChl a衍生物的合成分离方法
• 3.2.4 BChl a衍生物的测定方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 BChl a衍生物的紫外可见光谱分析
• 1H NMR分析'>3.3.2 BChl a衍生物的¹H NMR分析
• 3.4 讨论
• 第四章 锌细菌叶绿素的PDT性能研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料与主要仪器
• 4.2.2 实验分组
• 4.2.3 人白血病HL-60细胞的培养及处理方法
• 4.2.4 HL-60细胞PDT处理前后细胞形态学观察
• 4.2.5 HL-60细胞存活率检测方法
• 4.2.6 流式细胞仪（FACS）检测HL-60细胞死亡的方法
• 4.2.7 考马斯亮蓝（G-250）法测定细胞蛋白含量方法
• +,K⁺-ATP酶活性的测定方法'>4.2.8 Na⁺,K⁺-ATP酶活性的测定方法
• 4.2.9 丙二醛含量的检测方法
• 4.2.10 细胞膜流动性的检测方法
• 4.2.11 统计学处理方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 PDT处理前后HL-60细胞的形态学变化
• 4.3.2 HL-60细胞存活率测定结果
• 4.3.3 PI染色亚二倍体DNA（sub-G 1）法检测的HL-60细胞凋亡率结果
• 4.3.4 HL-60细胞在PDT处理后8h和24h的细胞凋亡和坏死结果
• +、K⁺-ATP酶活性检测结果'>4.3.5 Na⁺、K⁺-ATP酶活性检测结果
• 4.3.6 丙二醛含量检测结果
• 4.3.7 细胞膜流动性检测结果
• 4.4 讨论
• 4.4.1 Zn-BPhe a对HL-60细胞的光动力反应及对细胞死亡方式的影响
• 4.4.2 Zn-BPhe a的光动力反应对HL-60细胞的杀伤机理
• 结束语
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢