论文摘要
妊娠期高血压疾病是病理性妊娠常见疾病。尽管此病在妊娠晚期发病,但其发病因素可能在妊娠早期胎盘形成过程中就已存在,其发展最终累及胎盘、胎儿和孕妇各主要脏器。目前尚没有一种方法能在临床发病前,即妊娠早期预测该疾病的发生。近年来,从孕妇外周血中分离出胎儿细胞用于非侵入性产前诊断备受关注。孕妇外周血中胎儿细胞包括胚胎源性的（有核红细胞和淋巴细胞）以及胚外源性的（滋养细胞）,经富集后,这些细胞可用于非侵入性产前诊断。滋养细胞因在妊娠中形成很早,在侵入和增殖过程中进入母血,且在分娩后迅速被母体清除,因此,具有用于产前诊断的优势。但因缺乏标识滋养细胞的特异性抗体,有关成功富集循环中滋养细胞的研究报道很少。绒毛外细胞滋养细胞不表达经典的主要组织相容性复合物（major histocompability complex,MHC）Ⅰ类和Ⅱ类抗原,但选择性表达非经典的MHCⅠ类抗原——人类白细胞抗原G（human leucocyte antigen–G,HLA-G）。这种特异性表达提示HLA-G在母胎界面的重要作用。本研究以HLA-G特异性单克隆抗体MEM-G/9来标识孕妇外周血中绒毛外细胞滋养细胞,构建一种HLA-G阳性表达胎儿细胞免疫细胞化学染色-显微操作标识和分选方法,通过比较正常妊娠与妊娠期高血压疾病孕妇外周血中绒毛外细胞滋养细胞的数量,探讨孕妇外周血中HLA-G阳性表达胎儿细胞的数量与妊娠期高血压疾病的相关性,从而为妊娠期高血压疾病的早期诊断提供依据。第一部分HLA-G作为孕妇外周血中胎儿细胞特异性抗原标记物的研究目的建立利用滋养细胞表面抗原HLA-G进行免疫细胞化学染色,标记母血中胎儿滋养细胞的方法。建立高纯度、高特异性的细胞分选技术。方法采集正常妊娠、妊娠期高血压疾病、健康未孕女性外周血及新生儿脐带血,经密度梯度离心初步富集后涂片,用MEM-G/9（HLA-G单克隆抗体）进行免疫细胞化学染色,标记胎儿滋养细胞。结果正常妊娠、妊娠期高血压疾病外周血及新生儿脐带血中均观察到黄染的胎儿滋养细胞。阳性标记的胎儿滋养细胞具有鲜明的形态学、免疫学特征。滋养细胞单核,细胞呈类圆形,直径大于阴性细胞（孕妇外周血单个核细胞）,核大,染色质凝聚,胞浆较少,胞浆均匀黄染。母源性细胞胞浆无着色,与滋养细胞形成对比。结论以HLA-G作为分选标志,可以有效标记母血中胎儿滋养细胞,为后继准确、特异的细胞来源鉴定奠定基础。第二部分显微操作分选-应用Y染色体上的性别决定区序列鉴定母血中胎儿滋养细胞目的探索Y染色体上的性别决定区（sex-determining region of Y-chromosome,SRY）序列位点在无创性产前诊断中用于胎儿细胞鉴定、性别判断的可行性。鉴定免疫细胞化学所标记阳性细胞的胎儿源性。方法健康男性及健康未孕女性外周血各8例,以显微操作技术挑取外周血单个核细胞。采用引物延伸预扩增（primer extension preamplification,PEP）及聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术检测SRY基因。同样用所建立的方法,挑取妊娠期高血压疾病病例中免疫细胞化学标记的阳性细胞,鉴定其胎儿源性。结果8例健康男性外周血均检测有SRY基因,8例健康未孕女性外周血均未检测出SRY基因。对妊娠期高血压疾病病例中阳性细胞进行SRY基因的PEP-PCR检测,男胎检出率为100%（10/10）,女胎未检出率为100%（8/8）。单细胞SRY基因的检测结果与胎儿实际性别的符合率为100%,敏感性为100 %,特异性为100%。结论PEP-PCR技术可有效、准确的鉴定单个细胞的细胞源性。免疫细胞化学标记的阳性细胞是母血中胎儿滋养细胞。以HLA-G为分选标志,结合显微操作分选技术,可以有效获取高纯度的胎儿滋养细胞。第三部分孕妇外周血中HLA-G标识的胎儿细胞数量与妊娠期高血压疾病的相关性研究目的探讨孕妇外周血中滋养细胞数目是否与妊娠期高血压疾病存在相关性。方法对18例35～40孕周的妊娠期高血压疾病孕妇,16例36～40孕周的正常妊娠孕妇外周血经密度梯度离心后涂片,用MEM-G/9进行免疫细胞化学染色,计数黄染的滋养细胞。比较两组病例的滋养细胞数量差异。结果在6ml外周血中,正常妊娠病例HLA-G阳性细胞数为6.88±1.54,妊娠期高血压疾病病例HLA-G阳性细胞数为30.56±5.16,差异具有统计学意义（P<0.0001）。结论妊娠期高血压疾病孕妇外周血中滋养细胞数显著高于正常妊娠。孕妇外周血中滋养细胞数目与妊娠期高血压疾病存在相关性。通过妊娠早期计数孕妇外周血中滋养细胞数可能达到早期诊断此疾病的目的。本研究的创新点1.利用滋养细胞表面抗原HLA-G进行免疫细胞化学染色,建立了孕妇外周血中胎儿滋养细胞特异性标识体系。建立了可视化显微操作分选方法,所获得的胎儿滋养细胞纯度高。2.首次对孕妇外周血中HLA-G标记的胎儿滋养细胞数量与妊娠期高血压疾病相关性进行了研究。
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