基于核酸适体探针检测凝血酶的研究

论文摘要

核酸适体作为一种新型的分子识别工具,与传统的抗体相比不仅具有高度的亲和力与特异性,还具有易合成、易修饰、稳定性好等优点,在蛋白质研究中显示出了良好的应用潜力。近年来,结合核酸适体的分子特性,将蛋白质的检测转换为特异识别的核酸适体的检测,不仅避免了传统蛋白质检测方法中操作复杂、常需对蛋白质进行标记、不易保持活性等缺点,还有效地提高了蛋白质检测的效率与灵敏度。本文以凝血酶为目标蛋白质,基于核酸适体( aptamer )探针技术与荧光染料、荧光聚合物的光学特性,结合分子生物学中常用的工具酶,探讨了核酸适体探针用于蛋白质研究的新方法。从该思路出发,本文开展了以下三方面的研究工作:1、基于空间位阻效应与聚合反应检测凝血酶结合单链核酸分子在聚合酶和引物的作用下生成双链DNA的特性,将核酸适体的末端进行一定程度的碱基延伸,并设计一段与引物互补的序列,使得引物在聚合酶的作用下以核酸适体探针为模板进行聚合反应,生成双链DNA产物,聚合反应的进程被荧光染料Sybr Green I实时地转换为荧光信号。核酸适体与凝血酶特异性结合后,由于空间位阻效应,核酸适体探针末端的聚合反应速度受到了影响。利用荧光方法检测聚合反应初速度的变化,实现了对凝血酶简单、快速的检测。该方法结合聚合酶的作用与荧光染料的特性,避免了对核酸适体探针的荧光修饰,探针设计简单灵活,对蛋白质的检测具有良好的特异性,检测下限可达0.58 nmol/L。2、基于酶切保护作用与荧光聚合物检测凝血酶凝血酶与核酸适体探针结合后,对所结合的核酸适体探针可起到一定的酶切保护的作用。在外切酶的作用下,未与凝血酶结合的核酸适体探针被水解,而与凝血酶结合的核酸适体探针则被保护而不被酶解。将凝血酶失活以后,所结合的核酸适体探针被释放出来,与阳离子型噻吩聚合物形成二聚体结构,将聚合物的荧光熄灭。聚合物荧光信号的变化反映了核酸适体探针所结合凝血酶的量,从而实现了凝血酶的检测。该方法将对核酸检测具有优势的荧光聚合物进一步拓展至蛋白质的检测中,检测下限可达到93 pmol/L,可望发展成为一种探针设计简单灵活、成本低、通用的蛋白质检测方法。3、基于接近效应与聚合反应检测凝血酶利用凝血酶具有两个核酸适体的结合位点,分别将两条核酸适体设计成具有3’末端互补碱基序列的探针。当两条核酸适体探针同时结合到凝血酶的两个结合位点时,探针的末端借助接近效应形成稳定的杂交,在聚合酶的作用下发生聚合反应。聚合反应的进程被荧光染料Sybr Green I实时地转换为荧光信号,根据检测聚合反应的初速度,就可实现对凝血酶的浓度分析。本方法克服了基于双位点检测蛋白质方法中的一些不足,如探针设计、合成复杂或需要结合PCR技术放大信号等,直接将核酸适体探针设计为可在接近效应下发生聚合反应的线性探针,检测下限可达到6.9pM水平,并且具有良好的选择性。该方法探针设计灵活、简单、无需对探针进行化学修饰,结合恒温聚合反应与荧光染料,实现了对蛋白质高特异、高灵敏的检测,为基于核酸适体检测蛋白质的方法提供了一种新的思路。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 SELEX 技术
• 1.1.1 SELEX 技术的基本原理
• 1.1.2 SELEX 技术的发展
• 1.2 核酸适体的识别基础与信号转换方式
• 1.2.1 核酸适体的识别基础
• 1.2.2 核酸适体的信号转换方式
• 1.3 核酸适体在生物分析领域中的应用
• 1.3.1 生物小分子的分析
• 1.3.2 蛋白质的分析
• 1.3.3 细胞的分析
• 1.4 本论文拟开展的工作
• 第2章 基于空间位阻效应与聚合反应检测凝血酶
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂与仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 检测原理
• 2.3.2 核酸适体探针的筛选
• 2.3.3 检测条件的优化
• 2.3.4 凝血酶的定量检测
• 2.3.5 方法特异性的考察
• 2.4 小结
• 第3章 基于酶切保护作用与荧光聚合物检测凝血酶
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 检测原理
• 3.3.2 阳离子型噻吩聚合物的荧光性质
• 3.3.3 核酸适体探针的设计与筛选
• 3.3.4 外切酶反应条件的优化
• 3.3.5 凝血酶的定量检测
• 3.3.6 方法的特异性考察
• 3.4 小结
• 第4章 基于接近效应与聚合反应高灵敏检测凝血酶
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂与仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 检测原理
• 4.3.2 核酸序列的设计
• 4.3.3 温育时间对检测的影响
• 4.3.4 dNTP 浓度对检测的影响
• 4.3.5 凝血酶的定量检测
• 4.3.6 方法的特异性考察
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录（攻读学位期间所发表的学术论文目录）