论文摘要
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)是引起猪呼吸道疾病的主要病原之一。由其引起副猪嗜血杆菌病,又称猪格拉瑟氏病(Glasser’s disease)主要症状为多发性浆膜炎和关节炎,同时还会引发脑膜炎。但目前对副猪嗜血杆菌毒力基因的研究大都是在体外模拟自然感染所处环境下开展的,关于其毒力或致病因子并没有确切的报道。体内诱导抗原技术是一种不需要动物模型的高通量免疫筛选方法。通过利用已感染过目标病原的宿主血清来研究在宿主体内特异性表达的病原基因,能简便有效的鉴定疾病感染过程中表达的病原微生物抗原基因。该技术具有可用于鉴定急性和慢性感染中在体内特异表达免疫原性抗原,可同时捕获外膜蛋白和分泌蛋白,可以检测病原不同阶段和不同路径感染的情况等优点。在很多病原,尤其是人类疾病的病原中有重要应用,筛选到了很多有意义的致病相关因子,为开发新型药物靶标,研制高效疫苗,建立诊断方法,提供了理论基础。本课题针对副猪嗜血杆菌在宿主体内外差异表达的基因进行研究,应用体内诱导抗原技术对副猪嗜血杆菌地方分离株SH0165进行体内表达基因的筛选和鉴定。成功构建了该菌株的基因组表达文库,制备了猪的康复血清,运用免疫学技术筛选到24个体内特异表达基因,并对其进行了验证。主要研究内容如下：1.HPS基因组表达文库的构建：选取已经测序的SH0165菌株,提取基因组DNA,用Sau3AI酶切后回收0.5～3kb的片段,分别克隆到原核表达载体pQE80L/81L/82L中,转化大肠杆菌,构建了基因组表达文库。文库重组覆盖率大于80%,经酶切和PCR鉴定,插入片段大小正确。文库达到质量要求,可以进行筛选研究。2.血清抗体探针的制备：将SH0165菌株攻毒猪只,收集康复血清,用副猪嗜血杆菌和大肠杆菌的菌体抗原、破碎上清以及分泌抗原以硝酸纤维素膜为载体对其进行吸附。ELISA检测血清吸附效果,康复血清效价明显降低,可用于文库筛选。3.体内诱导抗原的筛选：用免疫印迹方法筛选经过IPTG诱导表达的文库,经过两次筛选后得到39个阳性克隆。通过测序分析,确定开放阅读框(ORF),共包括80个ORF。选取其中包含多个ORF的阳性克隆进行亚克隆,并再次使用免疫印迹方法对每个ORF进行筛选,最终得到24个体内表达基因。4.体内表达基因的验证：制备副猪嗜血杆菌SH0165的免疫血清。分别用经过大肠杆菌抗原吸附的免疫血清和康复血清作为一抗免疫鉴定24个体内表达基因,发现75%的基因与免疫血清不反应而与康复血清反应,证明这些基因是在宿主体内特异表达的。并选取其中编码宿主核酸酶抑制蛋白的基因gam和编码细胞杆状决定蛋白的基因mreC进行原核表达和蛋白纯化,通过Western blot从表达水平上验证了这两个基因的体内表达特性。使用体内诱导抗原技术筛选到的副猪嗜血杆菌的基因主要属于代谢,调控,粘附,转运,细胞结构以及抗药性几个方面。有些基因可能是副猪嗜血杆菌的潜在毒力因子,有的基因可能具有较好的免疫原性,可作为疫苗的候选基因,但还需要进一步验证。有的基因对于区分免疫血清和感染血清较为敏感,可作为诊断抗原,建立鉴别诊断方法。
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摘要Abstract缩略语表（Abbreviation）1. 文献综述1.1 副猪嗜血杆菌病1.1.1 副猪嗜血杆菌简介1.1.2 病原学及发病机理1.1.3 病原的分离鉴定及诊断1.1.4 相关毒力因子研究进展1.2 体内诱导抗原技术1.2.1 血清的选择、混合和吸附1.2.2 体外培养环境的选择1.2.3 文库构建1.2.4 DNA片段的大小1.2.5 文库筛选1.2.6 体内诱导抗原基因的分析1.2.7 体内诱导抗原技术的优点和局限性1.2.8 结论2. 目的及意义3. 材料3.1 菌株和质粒3.2 培养基、抗生素及其他试剂的配制3.3 体内诱导抗原筛选以及Western blotting相关溶液3.4 ELISA相关溶液3.5 蛋白纯化相关试剂3.6 酶制剂3.7 引物序列3.8 仪器3.9 试剂盒4. 实验方法4.1 副猪嗜血杆菌SH0165基因组表达文库的构建4.1.1 细菌基因组的提取4.1.2 基因组的酶切4.1.3 基因组片段的回收4.1.4 载体pQE80L,81L,82L的小量提取4.1.5 载体的酶切4.1.6 载体片段的回收4.1.7 基因组和载体的连接4.1.8 连接产物的转化4.1.9 文库的鉴定4.1.9.1 PCR鉴定4.1.9.2 酶切鉴定4.2. 康复血清的制备4.2.1 猪攻毒实验4.2.2 间接血凝检测康复血清抗体效价4.2.2.1 制备绵羊红细胞4.2.2.2 红细胞的醛化和鞣酸化4.2.2.3 IHA抗原的制备4.2.2.4 红细胞的致敏4.2.2.5 间接血凝测定康复血清效价4.2.3 吸附血清的处理4.2.3.1 血清中副猪嗜血杆菌SH0165和大肠杆菌DH5α菌体抗体的清除4.2.3.2 血清中副猪嗜血杆菌和大肠杆菌DH5α分泌抗原与胞内抗原的清除4.2.3.3 间接ELISA检测血清吸附效果4.3 文库的筛选4.3.1 文库的初次筛选4.3.2 文库的复筛4.3.3 文库的第三次筛选4.4 体内特异表达基因的验证4.4.1 副猪嗜血杆菌SH0165灭活疫苗的制备4.4.2 副猪嗜血杆菌SH0165免疫血清的制备4.4.3 ELISA检测免疫血清效价4.4.4 免疫血清中大肠杆菌抗体的扣除4.4.5 体内特异表达基因的验证4.5. gam基因和mreC基因蛋白水平上体内表达特异性的验证4.5.1 gam基因和mreC基因的扩增4.5.2 PCR产物的纯化4.5.3 PCR产物和载体的酶切回收4.5.4 PCR产物和载体的连接4.5.5 连接产物的转化4.5.6 转化子的鉴定4.5.7 重组质粒转化4.5.8 蛋白表达条件的确定4.5.9 蛋白表达形式的确定4.5.10 可溶性蛋白的纯化4.5.11 Western blot5. 结果及分析5.1 文库的构建5.1.1 基因组的提取及酶切5.1.2 载体的小量提取及酶切5.1.3 文库的鉴定5.1.3.1 文库的PCR鉴定5.1.3.2 文库的酶切鉴定5.1.3.3 文库质量检测5.2 吸附血清的制备5.2.1 康复血清效价的检测5.2.2 ELISA检测血清吸附效果5.3. 文库的筛选5.3.1 文库的初次筛选5.3.2 文库复筛5.3.3 文库的第三次筛选5.4 阳性克隆的测序及分析5.5 体内特异表达基因的验证5.5.1 ELISA检测免疫血清效价5.5.2 基因的体内表达验证5.6 gam基因和merC基因蛋白水平上体内表达特异性的验证5.6.1 gam基因和merC基因的扩增5.6.2 pET-gam和pET-mreC重组质粒的酶切鉴定5.6.3 gam基因和merC基因的原核表达5.6.3.1 表达条件的确定5.6.3.2 表达形式的确定5.6.3.3 蛋白纯化5.6.4 Western blot6. 讨论6.1 文库构建的优化6.2 抗体探针的制备6.3 文库的免疫筛选6.4 ivi基因分析6.5 体内表达基因的验证7. 小结参考文献致谢附录
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