晚期糖基化终产物受体在前列腺癌中的异常表达及其与视网膜母细胞瘤蛋白的相互作用

论文摘要

随着人类平均寿命的延长和诊断技术的不断提高,前列腺癌的发病率呈不断上升趋势。在美国,前列腺癌发病率在男性恶性肿瘤中居第一位,死亡率仅次于肺癌居第二位。在我国,前列腺癌的发病率虽低于西方国家,但随着生活方式的改变、人口的老龄化以及前列腺癌组织学肿瘤标志物等筛查技术的广泛应用,前列腺癌的发病率也在不断上升,目前已跃居男性泌尿生殖系统恶性肿瘤发病率第三位。前列腺癌的发病机制及发生发展的分子生物学基础至今仍不清楚。以往的研究表明,前列腺癌的发生发展与野生型p53、p16、PTEN、mn23、NKX3.1、Rb等抑癌基因的失活,c-myc、c-met、bcl-2、ras等癌基因的异常表达,AR、PSA、VDR等基因多态性及DNA甲基化等过程有关。而最近的研究表明,晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end products, RAGE）也与前列腺癌的发病密切相关。2003年,Kuniyasu等对40名前列腺癌术后患者的标本进行分析,发现肿瘤细胞及间质细胞中的RAGE及其配体amphoterin共同表达且水平较高,对已有转移的患者尤为明显；通过进一步的细胞学实验,他们认为在雄激素阻断过程中,RAGE-amphoterin系统通过旁分泌途径促进肿瘤细胞与间质细胞的相互作用,从而加速前列腺的发展和转移。2005年,Ishiguro等和Hermani等也通过研究提出,RAGE与配体amphoterin、AGE、S100A8、S100A9的相互作用对前列腺癌的发生、发展均有重要作用。2008年Allmen等进一步证明RAGE胞外端的V区域是其与配体作用介导前列腺癌生长所必须的。对RAGE的进一步研究,不但有利于揭示前列腺癌的发病机制,而且对前列腺癌的预防、诊断和治疗都将产生积极意义。然而目前RAGE促进前列腺癌细胞生长的机制尚不清楚。Rb基因位于人13号染色体q14,含有27个外显子,转录4.7kb的mRNA,编码Rb蛋白（928个氨基酸）。Rb蛋白的活性可以调控细胞周期。大量研究表明,转录因子E2F与DNA启动子近端元件结合后,促进转录预始复合物（PIC）的组装,使结构基因稳定表达,从而促进细胞生长。Rb蛋白作为一种修饰蛋白,有磷酸化和去磷酸化两种形式,去磷酸化为其活性形式。去磷酸化Rb与转录因子E2F有亲和力,可与之形成复合体,从而阻断其与顺式作用元件的结合,进而阻遏基因的表达。如Rb蛋白与E2F结合后,可阻断编码DNA聚合酶、胸苷激酶、二氢叶酸还原酶等的相关基因的表达,使这些酶类不能合成,DNA的生物合成亦受阻,抑制了细胞的生长。近年的研究表明Rb蛋白与前列腺癌的发生密切相关,但具体作用方式及机制还不明确。多数研究显示Rb蛋白能够抑制前列腺癌细胞的生长与增殖。其抑癌作用主要通过两种途径实现：第一,Rb蛋白通过影响细胞周期抑制前列腺癌细胞的生长。Rb蛋白与E2F蛋白结合为复合体,使E2F失活；而E2F是细胞从G1期进入S期的决定因子,它能够诱导多种与细胞生长有关基因的表达。因此,前列腺癌细胞的增殖受到了抑制。也有研究也表明在雄激素作用下,Rb蛋白的降解促进了LNCaP细胞的生长,其降解过程与泛素化和26S蛋白酶体的参与有关,而由cyclin A/Cdk2和cyclin B/Cdk1诱导的Rb磷酸化加速了其降解过程。第二,Rb蛋白可以通过特异性结合肿瘤发生相关的蛋白抑制肿瘤细胞活性。Rb蛋白能特异性地与3种DNA肿瘤病毒（SV-40,腺病毒和人类16型乳头瘤状病毒）的转化蛋白结合,即与SV-40大T抗原,E1A和E7结合并起到抑制肿瘤活性的作用。前列腺癌细胞DU145的突变Rb蛋白因丢失外显子21编码的35个氨基酸而不能与SV-40大T抗原和腺病毒E1A形成复合物。总之,Rb蛋白在前列腺癌的发生发展中起到重要作用,对Rb蛋白的深入研究,对进一步探讨前列腺癌的发生机制、寻找更为效的预防和治疗措施都极具意义。以往的工作中,我们已经克隆了人RAGE胞内段的原核表达载体,成功进行了人RAGE胞内段融合蛋白的表达与纯化,并利用T7噬菌体展示系统,初步筛选得到了25种与其有结合关系的蛋白或多肽,进而用ELISA法对这些蛋白或多肽进一步验证,并以BLAST软件在GenBank中对所得到的序列进行搜索和同源性分析,最终得到了9个为已知蛋白,其中一个便为视网膜母细胞瘤蛋白。本研究在此基础上力求进一步验证RAGE与Rb的相互作用,进而研究其生理意义,从而揭示RAGE在前列腺癌发病中的作业与机制,为前列腺癌的治疗和预防提供新的理论依据。本研究采用免疫组化法检测了前列腺癌病理标本和正常前列腺组织中RAGE的表达,结果在10例正常前列腺和前列腺癌组织标本中均能检测到RAGE的表达,而且前列腺癌组织中RAGE的表达量显著高于其在正常前列腺组织中的表达。检测结果与体外细胞培养检查结果是相同的。由此我们推测RAGE蛋白与细胞增生活跃之间可能有一定的相关性。由于免疫组化法不能精确定量,为进一步明确RAGE的表达与前列腺癌的关系,我们采用实时荧光定量PCR,量化RAGE在上述不同前列腺组织中的表达。结果表明,前列腺癌中RAGE的mRNA表达水平显著高于正常前列腺组织RAGE的mRNA表达水平（t=8.130,P=0.000）,前列腺癌中RAGE的mRNA表达水平为正常前列腺组织中RAGE的：mRNA表达水平的4.22±1.25倍。在生物体内,mRNA的表达与蛋白质的表达丰度并不总是一致,而只有蛋白质才有生物学功能,因此我们用Western blot的方法,在正常前列腺和前列腺癌组织均检测到相对分子质量为46 kDa的蛋白质条带,这与期望的人RAGE蛋白分子量的大小是一致的,表明前列腺组织有RAGE蛋白质的内源性表达,统计分析结果表明前列腺癌中RAGE蛋白的表达水平显著高于正常前列腺组织RAGE蛋白的表达水平（t=12.458,P=0.000）,前列腺癌组织RAGE的表达量是正常前列腺组织的1.42±0.36倍（P=0.000）,以上实验结果说明RAGE在前列腺癌组织和正常前列腺组织的表达存在显著差异,RAGE在前列腺癌组织中的表达显著高于正常前列腺组织,提示RAGE可能在前列腺癌发病机制中起重要作用。RAGE在前列腺癌中高表达,其对前列腺癌的发生和发展有何作用?我们做了MTT实验检测其对前列腺癌细胞增殖的影响。检测结果显示RAGE与其配体AGE-HSA相互作用能够促进前列腺癌细胞的增殖,结果与文献报道的一致,显示RAGE确实在前列腺癌的发生和发展中起重要作用。在以往的文献报道中,RAGE主要表达于细胞膜上,而Rb主要分布于细胞核内,在前列腺癌中两者是否有空间上的重叠?我们对此进行了研究。在前面的免疫组化实验中我们发现细胞核是RAGE主要的显色部位,在细胞质中也有显色,即RAGE蛋白是在细胞核与细胞质上表达的,而不是特异性的表达在细胞膜,为进一步证实我们的结果,排除抗体特异性带来的影响,我们用商业化的抗体重复了免疫组化实验,得到类似的结果。为更直观的检测RAGE在前列腺癌中的分布,我们用免疫荧光法观测内源性RAGE在前列腺癌细胞PC-3中的分布,结果显示RAGE在PC-3细胞中是细胞浆和细胞核细胞都有分布,而在SW480细胞中RAGE在细胞膜上富集。免疫组化实验和免疫荧光实验结果表明RAGE广泛分布在前列腺癌细胞的细胞核和细胞浆中,并且这种分布具有一定的特异性,因此RAGE的分布与Rb的分布存在空间上的重叠,两者相互作用存在空间上的可能性。随后我们用Rb和RAGE的抗体做了免疫荧光实验,观测内源性的Rb和RAGE在PC-3细胞中的分布情况,观测两者是否有空间分布上的重叠。实验结果显示Rb主要分布于细胞核内,RAGE全细胞分布,在细胞核两者存在共定位现象,此现象表明Rb和RAGE在细胞核内能形成复合体,两者可能存在相互作用。蛋白质是生理功能的执行者,是生命现象的直接体现者,蛋白质与蛋白质相互作用是构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分,蛋白-蛋白相互作用网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。其主要优点为：相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。为进一步验证Rb和RAGE是否存在相互作用,我们决定做体内免疫共沉淀实验。首先我们从美国哈佛大学的Nick Dyson教授获得了携带Rb基因cDNA序列的pFAD102质粒。为便于后续实验的检测,我们对pFAD102质粒进行了改造,用PCR的方法在Rb编码序列的5’端加上了FLAG表位标签,使其变为CMV-FLAG-RB质粒。经过酶切鉴定和序列测定鉴定,证明CMV-FLAG-RB质粒的序列是完全正确的。接着我们将CMV-FLAG-RB质粒和pcDNA3-HA-RAGE质粒按照1：1的比例共转染HEK293细胞,分别在转染后24h,36h,48h用western blot检测Rb和RAGE的表达量,结果显示CMV-FLAG-RB和pcDNA3-HA-RAGE均能在HEK293细胞中表达,Rb和RAGE在转染36小时后共同表达效率最高；RAGE的表达效率比Rb高,故以后的实验均将CMV-FLAG-RB和pcDNA3-HA-RAGE按照3：2的比例共转染36小时后进行。综上所述,我们的研究证明了RAGE在前列腺癌细胞中存在异常表达,相对正常细胞不仅表达量增高,其细胞亚定位也发生了改变,并且在AGE的刺激下,RAGE能够促进前列腺癌细胞的增殖。同时异常定位的RAGE与Rb存在共定位现象。为进一步说明RAGE与Rb是否有相互作用,我们又构建了Rb的真核表达载体,但由于时间所限,目前尚未进行体内免疫共沉淀实验,需要进一步的研究以得到确切的结果。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 RAGE在前列腺癌细胞中的异常表达与分布
• 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 试剂配制
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 荧光定量PCR
• 1.2.2 Western blot
• 1.2.3 免疫组织化学染色法
• 1.2.4 免疫荧光法
• 1.2.5 MTT法
• 1.3 统计学分析
• 结果
• 1 RAGE在前列腺癌组织和正常前列腺组织中的表达
• 1.1 研究对象
• 1.2 免疫组织化学法检测RAGE在前列腺组织中的表达
• 1.3 前列腺癌和正常前列腺组织中RAGE mRNA的定量
• 1.4 前列腺组织中RAGE的Western blot检测
• 2 RAGE与前列腺癌细胞增殖的关系
• 3 RAGE在前列腺癌细胞中的分布
• 3.1 免疫组化测RAGE在前列腺癌细胞中的分布
• 3.2 免疫荧光观测RAGE在前列腺癌细胞中的分布
• 4 RAGE在不同肿瘤细胞中的分布
• 第二部分 Rb基因的克隆与表达及其与RAGE在前列腺癌细胞中的相互作用
• 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 试剂配制
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 免疫荧光法观测RAGE与Rb共定位
• 1.2.2 CMV-FLAG-RB重组质粒的构建
• 1.2.3 CMV-FLAG-RB重组质粒在HEK293中表达效果的检测
• 结果
• 1 免疫荧光法观测内源性RAGE与内源性Rb在细胞内的共定位情况。
• 2 CMV-FLAG-RB重组质粒的构建与表达
• 2.1 Rb编码序列PCR扩增结果
• 2.2 CMV-FLAG-RB重组质粒鉴定
• 2.3 CMV-FLAG-RB重组质粒在真核细胞中的表达
• 讨论
• 小结
• 一、取得的结果
• 二、存在的问题
• REFERENCES
• 附录
• 成果
• 致谢
• 统计学证明