家蚕肠道产淀粉酶细菌的分离鉴定及其酶基因的克隆与表达

论文摘要

家蚕是产生较大经济效益和社会效益的重要经济昆虫，家蚕肠道微生物对其生长发育及微生态平衡具有重要作用。目前国内外关于家蚕肠道微生物的研究报道，多集中于肠道微生态系统结构、菌群致病性等方面，而关于家蚕肠道菌应用于产酶益生菌的研究较少。肠道产淀粉酶细菌，可帮助宿主更好地消化淀粉等营养物质，此外该类菌还有许多其它的益生功能。近些年来，关于益生菌在动物微生态制剂方面的应用，多集中于水产类及家禽生产中，而蚕用益生菌的研究未见报道，蚕业生产过程中一直存在着叶丝转化率较低，蚕病发生率高等问题，因而研究蚕肠道菌及其产酶并对产酶基因进行原核表达分析，在改善蚕肠微生态环境及蚕人工饲料开发上有一定意义。本文从大造品种家蚕5龄幼虫肠道中通过传统培养法分离纯化出部分可培养细菌，通过含淀粉的牛肉膏蛋白胨培养基筛选得到其中两株产淀粉酶菌株，用细菌扩增通用引物分别对产酶菌进行16SrDNA序列扩增并克隆测序，将所得测序结果与GenBank已有序列进行比对，该两株菌均与蜡样芽孢杆菌序列有99%的同源性，结合菌落形态学观察及菌体细胞革兰氏染色涂片显微镜镜检分析结果，鉴定所得菌株为芽孢杆菌属蜡样芽孢杆菌，DNS法测定菌株所产淀粉酶酶活，结果显示，该家蚕肠源性细菌所产酶具一定酶活力，且菌株的16SrDNA序列也与已有报导的蜡样芽孢杆菌序列有一定差异，因而具有一定的研究意义。鉴定得知分离产酶菌种属后，根据已解析的蜡样芽孢杆菌α-淀粉酶（Ec.3.2.1.1）基因设计引物，从该两株细菌的基因组DNA中分别扩增出了产淀粉酶基因片段，经克隆、测序和分析获得了家蚕肠源性蜡样芽孢杆菌淀粉酶基因的完整编码区ORF框序列，产酶基因扩增分别得到3414、3378个碱基序列，均包括完整的编码区1761bp，可编码586个氨基酸，比对分析属于α-淀粉酶超级家族，但这两株菌的产酶基因序列存在一定差异，其中，DZ-a号菌793位碱基为T，而DZ-h为C，DZ-a号菌1381位碱基为A， DZ-h为G，对应的氨基酸序列DZ-a号菌265位氨基酸为S，DZ-h为P，DZ-a号菌461位氨基酸为I，而DZ-h为V。将DZ-a号菌α-淀粉酶基因在大肠杆菌表达系统进行原核表达，得到分子量为66kD左右的目的蛋白，与DNAStar软件预测产物蛋白大小相符合。根据该编码区序列设计含酶切位点的引物重新扩增获得目的基因序列，连接到表达载体pET-28a（+）构建了该产酶基因的原核表达载体，经酶切鉴定后将该表达载体转化到含稀有密码子编码氨基酸的大肠杆菌宿主细胞Transetta（DE3）中，用IPTG进行了不同浓度的诱导表达，经SDS-PAGE电泳检测，表明被诱导的目的蛋白均得到了稳定的表达，这为以后对该菌株淀粉酶基因的真核表达及其功能的进一步研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 细菌α-淀粉酶研究进展
• 1.1.1 细菌α-淀粉酶的结构与特性
• 1.1.2 细菌α-淀粉酶的研究及应用
• 1.1.3 家蚕肠道菌研究概况
• 1.1.4 产酶益生菌在微生态制剂中的应用
• 1.1.4.1 益生菌简介
• 1.1.4.2 芽孢杆菌属细菌特点及作用机理
• 1.1.4.3 芽孢杆菌属细菌研究进展及应用
• 2 引言
• 2.1 研究的目的及意义
• 2.2 主要研究内容
• 2.2.1 家蚕肠道产淀粉酶菌筛选及菌种鉴定
• 2.2.2 产酶菌α-淀粉酶基因的克隆及分析
• 2.2.3 产酶菌α-淀粉酶基因原核表达的研究
• 2.3 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要实验仪器
• 3.2.2 主要生化试剂
• 3.2.3 常用溶液的配置
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 家蚕肠道产淀粉酶细菌的筛选
• 3.3.1.1 家蚕肠道菌的富集培养
• 3.3.1.2 家蚕肠道菌的分离纯化
• 3.3.1.3 产淀粉酶菌株的筛选
• 3.3.2 产淀粉酶菌株酶活测定
• 3.3.2.1 标准曲线的制作
• 3.3.2.2 酶活的测定
• 3.3.3 分离菌的种属鉴定
• 3.3.3.1 细菌基因组 DNA 的提前
• 3.3.3.2 16SrDNA 序列的 PCR 扩增及克隆测序
• 3.3.3.3 16SrDNA 序列分析及数据处理
• 3.3.4 产酶菌α-淀粉酶基因的克隆
• 3.3.4.1 引物设计及产酶基因克隆
• 3.3.4.2 克隆测序结果分析及系统发育树绘制
• 3.3.5 含淀粉酶基因原核表达载体的构建
• 3.3.6 重组蛋白的表达与鉴定
• 4 结果与分析
• 4.1 家蚕肠道菌产淀粉酶菌株的筛选及产酶活力检测
• 4.2 分离菌菌种鉴定
• 4.2.1 形态特征观察
• 4.2.2 产淀粉酶细菌菌株基因组总 DNA 的提取
• 4.2.3 细菌 16SrDNA 通用引物 PCR 扩增
• 4.2.4 PCR 扩增产物测序结果比对及进化树绘制
• 4.3 产酶菌α-淀粉酶基因克隆
• 4.3.1 产α-淀粉酶基因扩增结果及胶回收
• 4.3.2 PCR 扩增产物克隆测序结果分析及进化树绘制
• 4.4 产淀粉酶基因序列分析
• 4.5 原核表达载体的构建
• 4.6 重组蛋白的诱导表达
• 5 讨论
• 5.1 产酶菌株的分离与筛选
• 5.2 分离菌的种属鉴定
• 5.3 产酶菌α-淀粉酶基因的克隆测序
• 5.4 产酶基因原核表达结果分析
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介