与神经退行性疾病相关的氧化还原活性金属络合物的研究

论文摘要

神经退行性疾病是一类大脑和脊髓的神经元丧失的疾病。其中阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）和帕金森病（Parkinson’s Disease, PD）是全球发病率极高的老年神经退行性疾病,朊病毒病（Prion, PrP）是唯一具有传染性的神经退行性疾病。目前,有关诱导这类神经疾病发生的因素尚不明确。近年来的研究表明,除蛋白聚集之外,氧化应激效应被认为是导致神经退行性疾病的主要原因之一。由氧化还原活性的金属离子（如Cu（Ⅱ）、Fe（Ⅲ））催化产生的活性氧物质可以削弱线粒体的生理功能、破坏细胞膜等。基于上述考虑,本论文重点研究了氧化还原活性的金属离子在神经退行性疾病中所起的作用,探讨了金属离子与神经退行性疾病发病机理的关系,具体工作包括：一、β-淀粉样蛋白-Cu（Ⅱ）络合物（Aβ-Cu（Ⅱ））与AD的发生密切相关。本研究测定了Aβ-Cu（Ⅱ）氧化抗坏血酸（AA）的速率,提出了催化氧化的机制。所研究的Aβ包括Aβ（1-16）、Aβ（1-42）和Aβ（1-42）聚集体。催化AA氧化的次序依次为Aβ（1-16）-Cu（Ⅱ）>Aβ（1-42）-Cu（Ⅱ）>Aβ（1-42）聚集体-Cu（Ⅱ）>Aβ（1-42）-Cu（Ⅱ）聚集物。不同于游离的Cu（Ⅱ）,Aβ-Cu（Ⅱ）络合物催化AA氧化的最终产物为H2O2。尽管Aβ-Cu（Ⅱ）络合物催化产生的H2O2的破坏能力远低于游离Cu（Ⅱ）催化产生的羟基自由基（OH·）,但由于Aβ聚集体可以吸附在细胞膜表面,故Aβ-Cu（Ⅱ）催化产生的活性氧物质可能会对AD病人大脑的细胞膜造成破坏。二、多巴胺（DA）神经元的凋亡、铁离子的大量积累以及由α-突触核蛋白（alpha-synuclein,α-syn）聚集物所产生的路易小体是PD的三大病理学特征。α-syn可以与Cu（Ⅱ）形成α-syn-Cu（Ⅱ）络合物。本研究测定了α-syn-Cu（Ⅱ）络合物的氧化还原电位为0.018 V （vs. Ag/AgCl）,该络合物可被生物体内常见还原性物种AA还原成α-syn-Cu（Ⅰ）,而后者可被O2再氧化成α-syn-Cu（Ⅱ）。催化产生的H2O2可导致SY-HY5Y神经细胞的凋亡。因此,氧化应激效应可能是导致PD的重要原因之一,而α-syn-Cu（Ⅱ）在氧化应激过程中可能扮演了重要角色。三、Fe（Ⅲ）可以催化DA氧化生成黑色素。本研究表明三磷酸腺苷（ATP）可以与DA-Fe（Ⅲ）形成DA-Fe（Ⅲ）-ATP三元络合物,阻断Fe（Ⅲ）诱导DA氧化的途径,从而抑制了DA或DA-Fe（Ⅲ）的细胞毒性。正常情况下,ATP在细胞内的含量在1～10 mM之间,因此,DA与Fe（Ⅲ）在人体内完全可能以Ⅰ)A-Fe（Ⅲ）-ATP的形式存在。但在PD病人中,ATP的含量大大降低,因此,ATP的缺损可能是导致PD发病的重要原因之一。四、PrP蛋白可以络合Cu（Ⅱ）,参与Cu（Ⅱ）的代谢过程。PrP蛋白的聚集是朊病毒的主要病理学特征。PrP的N-端有四个PHGGGWGQ（简称OP）单元,当[PrP]：[Cu（Ⅱ）]>1时,Cu（Ⅱ）与PrP中的四个PHGGGWGQ形成OP4-Cu（Ⅱ）络合物；当[PrP]：[Cu（Ⅱ）]<1时,Cu（Ⅱ）可以与PrP中的每个PHGGGWGQ形成OP4-Cu（Ⅱ）4络合物。本论文系统研究了OP4-Cu（Ⅱ）及OP4-Cu（Ⅱ）4络合物的氧化还原特性,计算了相应的OP4-Cu（Ⅰ）及OP4-Cu（Ⅰ）4络合物的络合系数并测试了其在氧气中的稳定性。结果表明OP4-Cu（Ⅱ）不能够催化AA的氧化,而OP4-Cu（Ⅱ）4可以催化AA氧化产生H2O2。阐述了PrP在铜离子代谢及信号传递等方面的作用原理。五、金属硫蛋白（MT）具有重金属解毒、清除自由基等作用。近年来,MT在神经系统中的生理作用引起了人们的广泛重视。我们研究了谷胱甘肽氧化还原电对诱导的MT的金属释放过程。采用超滤膜对谷胱甘肽氧化还原电对和MT的反应液进行分离,利用电化学和紫外可见光谱等手段检测了反应前后MT中金属离子的释放和巯基变化情况。该研究对阐述MT在环境毒理学方面的作用具有重要意义,为研究其它氧化还原电对（如α-syn-Cu（Ⅱ）、Aβ-Cu（Ⅱ））与MT的相互作用过程提供了一种简洁、高效的手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 阿尔茨海默病的研究现状
• 1.1.1 阿尔茨海默病的定义
• 1.1.2 阿尔茨海默病发病机制假说
• 1.1.3 阿尔茨海默病的治疗进展
• 1.2 帕金森病的研究现状
• 1.2.1 帕金森病的定义
• 1.2.2 帕金森病的病理机制
• 1.2.3 帕金森病的治疗措施
• 1.3 朊病毒的研究现状
• 1.3.1 朊病毒的定义及分类
• 1.3.2 朊病毒的发病机制
• 1.3.3 朊病毒的预防
• 1.4 本论文的研究背景及意义
• 第二章 Aβ-Cu（Ⅱ）络合物催化抗坏血酸氧化的机理研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验试剂
• 2.2.2 实验仪器
• 2.3 实验过程
• 2.3.1 溶液配制
• 2.3.2 AA氧化动力学
• 2.3.3 电化学测试
• 2.3.4 原子力显微镜
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 AA初始氧化速率与AA浓度的关系
• 2.4.2 AA初始氧化速率与氧气浓度的关系
• 2.4.3 AA初始氧化速率与Aβ-Cu（Ⅱ）浓度的关系
• 2氧化AA的产物分析'>2.4.4 O₂氧化AA的产物分析
• 2.4.5 Aβ-Cu（Ⅱ）氧化AA的电化学研究
• 2氧化AA的速率'>2.4.6 不同Aβ-Cu（Ⅱ）络合物催化O₂氧化AA的速率
• 2.4.7 生物学意义
• 第三章 α-Syn-Cu（Ⅱ）络合物氧化还原活性及细胞毒性的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验过程
• 3.3.1 α-Synuclein（1-19）的合成
• 3.3.2 α-Syn的表达和纯化
• 3.3.3 质谱分析
• 3.3.4 电化学测定
• 2O₂的测定'>3.3.5 H₂O₂的测定
• 3.3.6 细胞毒性实验
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 α-Syn-Cu（Ⅱ）和α-synuclein（1-19）-Cu（Ⅱ）络合物的质谱分析
• 3.4.2 α-Syn-Cu（Ⅱ）络合物的氧化还原活性
• 2O₂'>3.4.3 α-Syn-Cu（Ⅱ）催化AA氧化产生H₂O₂
• 3.4.4 细胞毒性实验
• 3.4.5 生物学意义
• 第四章 DA-Fe（Ⅲ）-ATP三元络合物的结构表征及其细胞毒性的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验试剂
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验过程
• 4.3.1 紫外吸收光谱
• 4.3.2 质谱
• 4.3.3 电化学测试
• 4.3.4 高效液相色谱
• 4.3.5 细胞毒性实验
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 DA-Fe（Ⅲ）-ATP三元络合物的形成
• 4.4.2 ATP对DA-Fe（Ⅲ）氧化还原电位的影响
• 4.4.3 ATP对Fe（Ⅲ）催化DA氧化速率的影响
• 4.4.4 ATP对DA和DA-Fe（Ⅲ）细胞毒性的影响
• 4.4.5 生物学意义
• 第五章 Prion-Cu（Ⅱ）络合物的氧化还原活性研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 实验试剂
• 5.2.2 实验仪器
• 5.3 实验过程
• 5.3.1 电化学测试
• 5.3.2 AA氧化速率测定
• 2O₂测定'>5.3.3 H₂O₂测定
• 5.4 结果与讨论
• 4-Cu（Ⅱ）及OP4-Cu（Ⅱ）₄络合物的伏安特征'>5.4.1 OP₄-Cu（Ⅱ）及OP4-Cu（Ⅱ）₄络合物的伏安特征
• 4-Cu（Ⅱ）及OP-Cu（Ⅱ）络合物与生物还原剂AA的反应'>5.4.2 OP₄-Cu（Ⅱ）及OP-Cu（Ⅱ）络合物与生物还原剂AA的反应
• 5.4.3 不同模式下PrP与Cu（Ⅰ）的络合系数
• 5.4.4 生物学意义
• 第六章 氧化还原电对诱导的金属硫蛋白金属释放过程的研究
• 6.1 引言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 实验试剂
• 6.2.2 实验仪器
• 6.3 实验过程
• 6.3.1 汞膜电极的制备
• 6.3.2 锌离子释放量的测定
• 7-MT中巯基的测定'>6.3.3 Zn₇-MT中巯基的测定
• 6.4 结果与讨论
• 7-MT中Zn²⁺的释放量'>6.4.1 微分脉冲伏安法测定GSH-GSSG诱导Zn₇-MT中Zn²⁺的释放量
• 7-MT中巯基的变化'>6.4.2 GSH-GSSG诱导Zn₇-MT中巯基的变化
• 6.5 小结
• 第七章 工作总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间主要的研究成果