论文摘要
抗菌肽是一类广泛存在于生物体内的小分子多肽,具有广谱抗菌,理化性质稳定等特性,是生物体自身防御系统的一部分。原核生物、植物、动物（包括无脊椎动物和非脊椎动物）都可以产生由基因编码、核糖体合成的抗菌肽。由于抗菌肽分子的两亲性结构和正电荷可使其在细菌细胞质膜上穿孔而形成离子孔道,造成细菌细胞质膜结构破坏,引起胞内水溶性物质大量渗出,而最终导致细菌死亡。这种独特的抗菌机制不会使病原微生物菌株变异而产生抗药性,而且对机体无毒副作用,这将为解决细菌对青霉素等传统抗生素日益增强的耐药性及药物残留这两大棘手的难题提供新途径。更为重要的是抗菌肽对真核细胞几乎没有作用,仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,因而具有重要的开发应用前景。目前,为了降低畜禽体内药物残留,提高动物性食品安全性,现对畜禽体内自然产生的抗菌肽的功能进行了解并设计一种方法来调节动物体内自然抗菌肽的功能便显得极为重要,其中通过基因工程手段诱导表达抗菌肽,以及改造合成抗菌肽基因工程,已越来越受到人们的重视。PMAP-23与PG-2是猪血液中两种抗菌肽。PMAP-23与PG-2属于Cathelicidins家族,起源于骨髓细胞,组成性的以前肽（Propeptides）形式储存在周边PMNs（多形核嗜中性白细胞）颗粒中。当PMNs激活和脱颗粒时,内源性弹性蛋白酶把成熟肽从前肽中切割出来。PMAP-23成熟肽由23个氨基酸残基组成,呈发卡结构。PMAP-23抗G+（革兰氏阳性菌）和G-（革兰氏阴性菌）。PG-2成熟肽由16个氨基酸残基组成,不仅对G+和G-有作用,同时也抗真菌（F）和囊膜病毒（V）,PG-2的抗微生物活性保持在生理NaCl浓度,不受细胞外阳离子或血清成分抑制。1.pMAP-23与pG-2基因的克隆本试验从生猪骨髓中提取总的RNA,并根据Gen Bank中收录的猪源抗菌肽PIGPMAP23P与PIGLAP的成熟肽pMAP-23与pG-2基因设计引物。通过RT-PCR得到pMAP-23与pG-2基因,纯化并与克隆载体pMD18-T相连,通过双酶切做初步的鉴定,酶切成功,再经测序鉴定。序列分析结果表明PIGPMAP23P的成熟肽pMAP-23基因全长426bp与Gen Bank中报道序列有两个碱基发生突变,但氨基酸没有突变,PIGLAP的成熟肽pG-2基因全长362bp与Gen Bank中报道的序列完全相同,基因无突变,见附表。2.pMAP-23与pG-2基因的原核表达将pMAP-23与pG-2基因阳性克隆产物酶切回收目的片段,与制备好的pET-28a空载体相连。再经双酶切鉴定,连接成功后,将pET-28a-pMAP-23与pET-28a-pG-2的阳性质粒转入到大肠杆菌BL21感受态,经30℃、4小时的IPTG诱导,SDS-PAGE电泳鉴定。结果表明,pMAP-23基因诱导出大于18KDa的融合蛋白,pG-2基因诱导出略大于18KDa融合蛋白。再经0-7小时,30℃诱导,塞选出最佳诱导时间是5-6小时。本实验研究成果可以为针对猪只常见病的病原微生物的体外实验提供实验依据。体外实验的研究成果可为PMAP-23与PG-2体内活性及活性增强试验奠定基础。