论文摘要
目的：观察益气养阴祛瘀方药对博莱霉素诱发特发性肺纤维化（IPF）大鼠相关细胞因子的影响，探讨其治疗作用机理，进一步揭示IPF形成的病理机制。方法：将120只Sprague Dawley（SD）大鼠（雌雄各半）置于实验环境中适应性饲养1周后，随机分为5组（每组24只）：①正常对照组（对照组，control group）；②IPF模型组（模型组，model group）；③强的松组（prednisone group）④益气养阴祛瘀方低剂量组（低剂量组，low-dose group）；⑤益气养阴祛瘀方高剂量组（高剂量组，high-dose group）。根据文献方法，造模各组大鼠气管内滴注博莱霉素A5（BLMA5，5mg/kg，溶于0.2ml无热源生理盐水），复制IPF模型；对照组气管内滴注等量无热源生理盐水。造模第2d始，对照组与模型组灌服生理盐水，10ml／kg；强的松组灌服强的松6mg／kg（用蒸馏水溶解配成50％的混悬液），以0.6mg／ml灌胃；低剂量组与高剂量组均灌服中药益气养阴祛瘀方水煎剂，分别为12.3g／kg、24.6g／kg（相当于临床成人用药量的7倍和14倍），分别以1.23g／ml、2.46g／ml的混悬液灌胃；以上均为每日1次。各组动物于造模后第7d、14d、28d分3批断头处死。取血，立即以4℃3500r／min离心5min，分离血清，并取肺组织制成10％的组织匀浆，检测血清及肺组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β1（TGF-β1）、γ干扰素（IFN-γ）和肝细胞生长因子（HGF）含量变化；取右肺1cm×1cm×1cm大小组织，4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，行HE染色、Masson染色以及SP免疫组化染色，光镜下观察肺组织病理形态学变化和TGF-β1的表达特征。结果：1一般状态观察：对照组大鼠饮食如常，反应灵敏，体毛顺滑光泽，二便正常，无死亡现象。模型组大鼠存在不同程度的咳嗽，呼吸困难，蜷缩少动，精神萎顿，毛发直立，皮毛枯槁，多见倒竖现象。高、低剂量组大鼠，尤其是随着用药时间的延长，精神渐趋好转，毛发愈发光整，呼吸渐趋平稳，活动增多，食量增加；强的松组大鼠状态亦趋好转。2各组大鼠血清及肺组织中促纤维因子TNF-α、TGF-β1含量变化2．1各组大鼠血清及肺组织中TNF-α含量变化结果显示：模型组大鼠血清和肺组织中TNF-α含量各时间点较对照组明显升高（P＜0.01）；治疗各组各时间点血清和肺组织中TNF-α含量均较模型组明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；高剂量组血清中TNF-α含量第7d和28d时均较强的松组明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；低剂量组与高剂量组肺组织中TNF-α含量第7d和14d时均较强的松组明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。2．2各组大鼠血清及肺组织中TGF-β1含量变化结果显示：模型组大鼠血清和肺组织中TGF-β1含量各时间点较对照组明显升高（P＜0.01）；强的松组血清中TGF-β1第7d时较模型组明显降低（P＜0.01）；低剂量组与高剂量组血清中TGF-β1含量各时间点均较模型组明显降低（P＜0.01）；治疗各组肺组织中TGF-β1含量各时间点均较模型组明显降低（P＜0.01）。高剂量组血清和肺组织中TGF-β1含量各时间点均较强的松组明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。3各组大鼠血清及肺组织中抗纤维因子IFN-γ、HGF含量变化3．1各组大鼠血清及肺组织中IFN-γ含量变化与对照组比较，第7d时模型组血清和肺组织中IFN-γ含量明显升高（P＜0.01）；以后模型组血清和肺组织中IFN-γ含量逐渐降低，第14d时无统计学意义（P＞0.05）；第28d时模型组血清和肺组织中IFN-γ含量明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，强的松组血清和肺组织中IFN-γ含量第7d时明显降低（P＜0.01）；低剂量组与高剂量组血清和肺组织中IFN-γ含量第7d时明显降低（P＜0.01）；第14d和第28d时明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。三治疗组比较，低剂量组与高剂量组血清中IFN-γ含量第7d时较强的松组明显降低（P＜0.01）；第14d和第28d时较强的松组明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；低剂量组与高剂量组肺组织中IFN-γ第14d和第28d时较强的松组明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；第7d时高剂量组血清中IFN-γ含量较低剂量组明显降低（P＜0.01）；第14d和第28d时高剂量组肺组织中IFN-γ含量较低剂量组明显升高（P＜0.05）。3．2各组大鼠血清及肺组织中HGF含量变化与对照组比较，模型组血清中HGF含量在疾病初期即升高达峰值，随后降低，但仍有显著差异（P＜0.05或P＜0.01）；模型组大鼠肺组织中HGF在7d时含量明显升高（P＜0.01）；以后呈逐渐下降趋势，第28d时含量则明显减少（P＜0.01）。与模型组比较，益气养阴祛瘀方组血清中HGF含量各时间点显著降低（P＜0.05或P＜0.01）：益气养阴祛瘀方组肺组织HGF含量各时间点均明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；强的松组大鼠肺组织中HGF含量各时间点未见统计学意义（P＞0.05）。三治疗组间比较，低剂量组血清中HGF含量第28d时较强的松组明显降低（P＜0.05）；高剂量组血清中HGF含量第14d和第28d时较强的松组明显降低（P＜0.05）；低剂量组与高剂量组肺组织中HGF含量第14d和第28d时较强的松组明显升高（P＜0.05）。4肺组织形态学观察4．1肉眼观察：对照组双肺外观无异常，肺叶轮廓清晰，表面光滑、粉红色、弹性良好。模型组第7d双肺见密集的点状出血，灶状淤斑，肺体积增大；第14d双肺灰白色，局部见大小不等结节样改变，边缘有点状出血，部分肺叶体积缩小，表面有白色结节；第28d双肺苍白，体积缩小，硬度增加，表面结节样改变、串珠状充气空泡及条索状凹沟。高、低剂量组与强的松组肺组织部分呈暗红色，偶见大小不等结节样改变，边缘有点状出血及部分肺叶体积缩小。4．2光镜观察：参照Szapiel等的方法用HE染色评定肺组织肺泡炎程度，Masson染色评定肺组织纤维化程度。模型组大鼠可见肺泡腔及肺间质弥漫性炎细胞浸润，肺泡间隔增宽，部分区域肺泡隔断裂，肺泡萎陷、甚至结构消失，部分肺泡代偿性气肿，且病变随时间延长而有所加重；至后期均发生肺间质纤维化，且多为中重度；（Masson染色下可见到肺间质中胶原纤维显著增多）。经用药干预，各治疗组大鼠肺泡炎和肺纤维化程度均较模型组大鼠明显减轻；高剂量组大鼠肺泡炎和肺纤维化减轻程度高于低剂量组和强的松组。5各组大鼠肺组织中TGF-β1表达特征结果显示：对照组大鼠肺组织中未见明显表达的阳性细胞；与对照组比较，模型组大鼠肺组织细胞胞浆可见明显增强的TGF-β1表达（P＜0.01）。与模型组比较，各治疗组大鼠肺组织中TGF-β1表达明显减弱（P＜0.05或P＜0.01）；各治疗组间大鼠肺组织中TGF-β1。表达未见统计学意义（P＞0.05）。结论：1 IPF状态下，血液和肺组织中促纤维因子TNF-α、TGF-β1含量的明显增加，以及抗纤维因子IFN-γ、HGF含量的减少，共同介导了持续进展的微小上皮损伤和肺损伤后的异常修复的过程。此种变化，是肺纤维化可能的发病机制之一。2益气养阴祛瘀方可以通过降低血清、肺组织中TNF-α、TGF-β1的含量，调整血清、肺组织中IFN-γ、HGF的变化，从而减弱细胞因子网络对于肺间质纤维化形成的促进作用，抑制纤维化的发展，达到防治肺纤维化的目的。3 IPF状态下，肺组织存在TGF-β1高表达特征，表明TGF-β1可促进纤维化形成；益气养阴祛瘀方药可通过下调TGF-β1表达来抑制细胞外基质沉积，促进细胞外基质降解，改善其代谢状态，减缓肺纤维化进程。