论文摘要
胰岛移植或β细胞替代足糖尿病最理想的治疗手段,但细胞来源严重匮乏及免疫排斥反应限制了临床的广泛应用。将人胚胎干细胞（human embryonicstem cell,hESCs）诱导为胰岛素分泌细胞,成为β细胞替代物的新资源,为解决细胞来源匮乏带来了希望。已有多种方案由ESCs获得胰岛素分泌细胞,但均存在各种限制,目前仍缺乏将ESCs诱导分化为有功能的胰岛素分泌细胞的最佳方案。探索诱导人hSCs分化为成熟且有功能的胰岛素分泌细胞,并制定出有效而高效的分化方案,成为本课题的主要研究目的。第一,本研究摸索了在体外培养、扩增、冻存、复苏hESCs细胞株（PKU1）的条件,并对其特异性标志物进行了检测。结果显示,hESCs经多次传代后仍然表达OCT-4和Nanog基因,免疫荧光法显示呈OCT-4、SSEA-4阳性,流式细胞术分析显示,OCT-4、SSEA-4阳性细胞比例分别达89.38%、83.44%;染色体核型分析表明为正常女性染色体核型（46,XX）。第二,采用酶消化法分离出胎龄14-18W的胎儿胰岛,经悬浮培养、双硫腙（DTZ）染色后种植到组织培养皿中,再以免疫荧光法检测一些细胞标志物的表达。结果显示,悬浮培养条件下,胎龄14-18W的胎儿胰岛细胞聚集成球形细胞簇,呈DTZ阳性,培养液中能检测到一定量的胰岛素和C-肽,贴壁培养后还能检测到胰岛细胞标志物insulin和glucagons及前体细胞标志物PDX-1、CK-19和Nestin的表达,证实14-17W胎儿胰岛已具备一定的胰岛特性和前体细胞的特征。第三,模拟胰腺发育分化的生理过程,研究设计出五阶段诱导方案,具体如下:（1）.撤除分化抑制因素使hESCs形成拟胚体（EBs）,悬浮培养48h;（2）.将EBs转移至明胶包被的组织培养皿后,加入含Activin A和bFGF及LY294002的诱导培养基Ⅰ诱导5天,向定形内胚层诱导分化。RT-PCR法鉴定SOX17和FOXA2的基因表达,与同期自发分化的EBs进行比较,免疫荧光法检测SOX17的表达。（3）.将细胞转移至laminin包被的培养皿,加入含bFGF、KGF、EGF、GLP-1、尼克酰胺的低血清诱导培养基Ⅱ作用14d,向胰腺前体细胞诱导。RT-PCR法和免疫荧光化学法分别检测前体细胞标志物PDX-1及Ngn3表达。（4）.添加含IGF-1、betacellulin、尼克酰胺、GLP-1、laminin的低血清诱导培养基Ⅲ作用14d,促进胰岛细胞分化,RT-PCR法检测细胞胰岛素基因的表达,免疫荧光化学法检测分化细胞胰岛素和C-肽的表达。（5）.将细胞转移至低黏附性培养皿中,撤除IGF-I继续培养3天,促进细胞成熟。应用双硫腙（DTZ）染色液对获得的细胞团进行染色,应用RT-PCR法检测了胰岛素和胰高血糖素基因表达,应用RIA法分别测定了获得的细胞团培养液上清和胞浆中的胰岛素、C-肽含量,并与胎儿胰岛培液上清进行比较,静态培养胰岛素释放试验测定胰岛素与C-肽分泌是否呈葡萄糖反应性。结果（1）.hESCs悬浮培养2d后,形成类球形EBs;（2）.经第二阶段诱导后,细胞表达SOX17和FOXA2基因,且表达量高于同期自发分化的EBs,基本不表达外胚层标志物SOX1,随诱导时间延长,FOXA2表达逐渐增强;免疫荧光化学法显示,诱导5天的细胞胞核呈SOX17。（3）.经第三阶段的诱导,细胞呈上皮样集落,RT-PCR法检测到细胞表达PDX-1、Ngn3及微弱的Pax4基因,免疫荧光法显示细胞呈PDX-1阳性。（4）经第四阶段的诱导,集落中一部分细胞聚集成多层,RT-PCR显示,不同诱导时期均有胰岛素基因的表达,且随诱导时间延长表达水平逐渐升高;免疫荧光显示,部分细胞呈胰岛素和C-肽阳性。（5）.经第五阶段诱导后,hESCs来源的细胞呈类似胎儿胰岛的胰岛样细胞簇（ICCs）,呈DTZ阳性,RT-PCR检测到Insulin和Glucagon基因表达,RIA法检测到ICCs培液上清中含胰岛素与C-肽,水平与15-17W胎儿胰岛培液上清相近（P＞0.05）,胞浆内的胰岛素和C-肽水平分别为1089.2±217.06μIU/ml和181.33±30.12ng/ml,静态培养胰岛素释放试验验证了ICCs分泌的胰岛素呈糖反应性。应用五阶段分化方案,hESCs能够有效的分化为具有部分β细胞特性和糖反应性胰岛素分泌功能的细胞,为DM细胞替代治疗提供了有潜力的细胞来源和良好的临床应用前景。
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- [1].人骨髓间充质干细胞原代提取及成神经诱导分化[J]. 世界最新医学信息文摘 2019(A1)
- [2].骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展[J]. 中国当代医药 2014(33)
- [3].缺氧对大鼠骨髓间充质干细胞骨向诱导分化过程中骨钙素基因表达的影响[J]. 医学动物防制 2013(01)
- [4].酸浆种子诱导分化试验[J]. 林业科技 2016(03)
- [5].哺乳动物精原干细胞诱导分化研究进展[J]. 基因组学与应用生物学 2015(05)
- [6].缺氧对大鼠骨髓间充质干细胞骨向诱导分化过程中碱性磷酸酶活性的影响[J]. 现代中西医结合杂志 2010(20)
- [7].骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的研究进展[J]. 医学综述 2008(04)
- [8].自发和诱导分化产生的人胚胎干细胞源性视网膜色素上皮补体H因子的表达[J]. 四川大学学报(医学版) 2020(01)
- [9].绵羊成肌细胞的纯化、培养、鉴定及其成肌诱导分化研究[J]. 河北农业大学学报 2016(01)
- [10].骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中端粒酶的变化[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2008(43)
- [11].异种骨对神经干细胞诱导分化的作用[J]. 广东医学 2015(17)
- [12].骨髓间充质干细胞的诱导分化研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医 2018(11)
- [13].脂肪干细胞的诱导分化及其来源的研究[J]. 现代生物医学进展 2017(24)
- [14].松辽黑猪前体脂肪细胞分离及诱导分化[J]. 吉林农业大学学报 2020(03)
- [15].间充质干细胞在生殖领域诱导分化的研究进展[J]. 中国计划生育和妇产科 2015(01)
- [16].山羊骨骼肌卫星细胞系分离、培养及其成肌诱导分化研究[J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版) 2013(01)
- [17].骨髓间充质干细胞分化为神经细胞研究进展[J]. 国际骨科学杂志 2011(02)
- [18].人骨髓间充质干细胞诱导分化为汗腺细胞的实验研究[J]. 汕头大学医学院学报 2010(04)
- [19].间充质干细胞向胰岛样细胞诱导分化的研究进展[J]. 医学综述 2013(16)
- [20].不同添加剂对花生诱导分化的影响[J]. 广东农业科学 2011(S1)
- [21].人脐血间充质干细胞源性心肌细胞的诱导分化研究[J]. 国际心血管病杂志 2010(05)
- [22].人牙髓细胞向成牙本质细胞诱导分化中细胞周期变化[J]. 热带医学杂志 2008(01)
- [23].大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2008(12)
- [24].诸江课题组在ＲIG-Ⅰ调控白血病诱导分化机制方面取得新发现[J]. 上海交通大学学报(医学版) 2014(03)
- [25].大鼠原代前脂肪细胞及诱导分化方法的探讨[J]. 中国老年学杂志 2013(03)
- [26].人脐血源性间充质干细胞向心肌细胞的诱导分化(英文)[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2008(47)
- [27].骨肉瘤诱导分化研究进展[J]. 中国骨肿瘤骨病 2008(05)
- [28].牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化[J]. 中国畜牧兽医 2014(07)
- [29].K562细胞红系诱导分化方法的实验研究[J]. 医学综述 2012(05)
- [30].脂肪源性神经干细胞诱导分化为γ-氨基丁酸能神经元的体外研究[J]. 第三军医大学学报 2012(11)