论文题目: Spindlin1的蛋白结构解析及相互作用蛋白的寻找
论文类型: 博士论文
论文专业: 病理学与病理生理学
作者: 秦立篷
导师: 裴雪涛
关键词: 结晶,突变
文献来源: 中国人民解放军军事医学科学院
发表年度: 2005
论文摘要: spindlin1是ssty/spin家族成员,编码一个237个残基的多肽链。它的功能和结构基础目前所知甚少。德国学者对已经报告的spin/ssty家族成员进行了生物信息学分析,发现了一个Spin/Ssty repeat,该实验组认为这个Spin/Ssty repeat是一个新的motif、是独立的功能单位,对该motif进一步分析,预测会形成一种未经报道过的结构---four-stranded beta-structure。 我们原核表达了GST融合的Spindlin1,亲和纯化、切去GST后经阴离子交换色谱纯化,得到了高纯度的重组Spindlin1。我们采用气相悬滴法获得了可供X线衍射的晶体,经过结晶条件优化后,进行了同步辐射收集数据。衍射数据经过软件处理后我们得到了Spindlin1的空间结构,该结构数据已经提交到PDB数据库,登录号为1YDJ,目前数据还没有释放。 我们实验组用真核表达载体pEGFP-N1-spindlin1转染NIH 3T3细胞,对筛选出的稳定转染细胞进行了细胞生物学检测。因此我们在生物信息学和晶体结构的基础上设计了突变体。真核突变载体已经转染NIH 3T3细胞,正在扩大培养。原核突变载体已经交给清华大学结构生物学实验室。这部分工作将最终建立起结构一功能的关系。
论文目录:
缩略词表
第一部分 Spindlin1蛋白结构的解析
摘要
Abstract
前言
一、Spindlin1的原核表达
(一) 材料
1、质粒与菌株
2、引物序列
3、工具酶与DNA分子量标准
4、试剂盒
5、主要试剂
6、主要仪器
7、常用溶液
8、互联网资源
(二) 方法
1、引物设计及PCR反应
2、PCR产物的纯化
3、目的片断与pGEX-2T载体的连接
4、感受态细菌的制备
5、连接产物的转化
6、质粒小量提取
7、转化子鉴定
8、测序
9、原核表达
10、蛋白电泳
11、染色与脱色
12、原核表达条件的优化及表达形式分析
(三) 结果
二、重组Spindlin1蛋白的纯化
(一) 材料
1、主要仪器
2、常用溶液
3、互联网资源
(二) 方法
1、低温诱导表达
2、破菌
3、亲和纯化
4、蛋白质理化性质分析
5、离子交换色谱纯化
6、蛋白浓缩、浓度测定
(三) 结果
三、重组Spindlin1蛋白的结晶与解构
(一) 重组Spindlin1发蛋白的结晶
1、常用试剂
2、结晶方法
(二) 晶体质量评估
(三) 优化结晶条件
(四) 重组Spindlin1蛋白晶体的重原子浸泡
(五) 重组Spindlin1蛋白晶体的结构解析
1、工具软件
2、数据库
(六) 结果
四、突变实验
(一) 材料
(二) 方法
(三) 结果
讨论
结论
参考文献
第二部分 Spindlin1相互作用蛋白的寻找与确认
摘要
Abstract
前言
一、多克隆抗体制备
二、多克隆抗体鉴定
三、epitope tagging
四、GST pulldown
(一) 材料
(二) 方法
(三) 结果
五、质谱检测与数据库查询
(一) 仪器
(二) 数据库
(三) 结果
六、蛋白相互作用的确认
(一) 基因克隆与载体构建
(二) GST pulldown
(三) 动态光散射
(四) 交联电泳
(五) 免疫共沉淀验证蛋白相互作用
讨论
结论
参考文献
致谢
博士期间撰写的论著
发布时间: 2005-09-05
参考文献
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