论文摘要
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)一个真核高效表达系统,已经有400多种基因工程产品在该体系上表达,如：肿瘤坏死因子,重组人血清白蛋白等。巴斯德毕赤酵母在生产中常采用大规模高密度发酵,该方法能有效提高目标物的产量,但产生了大量的废菌体,对环境产生严重污染,寻找巴斯德毕赤酵母废菌体高值化利用的方法迫在眉睫。本论文以生产重组人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母为研究对象,进行了以下几方面的研究。首先,对巴斯德毕赤酵母各生物质含量进行了成分分析,结果显示,毕赤酵母含有36.8%的多糖,45.1%的蛋白质,11.9%的脂肪,8.9%的核酸,灰分含量为7.4%。其中多糖主要由葡聚糖和甘露聚糖组成,葡聚糖含量为15.9%,甘露聚糖的含量为20.2%。其次,确定了葡聚糖和甘露聚糖的提取分离条件,巴斯德毕赤酵母菌体经过诱导自溶、高压热水、超声波处理、异丙醇除脂、蛋白酶水解和冷冻干燥可以得到葡聚糖纯品。通过单因素实验和响应曲面法优化得到诱导自溶的最佳条件为时间32.9h,pH 6.4,温度46.9℃。在该实验条件下,自溶率达到了39.4%。高压热水处理的最佳条件为：料液比1：30,pH 7.5,处理时间为4 h。超声波处理的最佳条件为：20KHz,工作10s,间隔2s,超声功率400w,处理次数60次,料液比为2.5%。木瓜蛋白酶水解去除蛋白质的效果最好,最佳条件为pH 6.5,温度37℃,添加量为60 U/g蛋白质,反应时间4h。经过该方法分离纯化后,葡聚糖的纯度为85.3%,得率为11.7%。从巴斯德毕赤酵母菌体自溶上清液、高压热水处理和超声波处理的上清液,通过酶解,乙醇沉淀可以得到甘露聚糖。使用该方法得到的甘露聚糖的纯度为94.2%,得率为11.2%。最后,研究了巴斯德毕赤酵母葡聚糖的生物学活性。结果显示,葡聚糖在增强机体免疫力,改善血脂代谢水平和提高机体抗氧化能力方面均具有良好的效果。在免疫活性测定中,当小鼠灌胃给药量为150mg/(kg·d)时,吞噬指数可提高17.8%,脾脏指数提高了17.6%,肝脏指数提高32.1%。在改善血脂代谢水平试验中,小鼠灌胃给药50mg/(kg·d)时,可提高高密度脂蛋白含量10.1%；降低低密度脂蛋白含量5.8%,当给药量提高到150mg/(kg·d)时,可降低低密度脂蛋白含量12.5%。在抗氧化活性测定时,当给药量为50mg/(kg·d)时,可提高总抗氧化能力14.2%、SOD活力12.3%、过氧化氢酶活力8.6%,同时降低丙二醛含量6.2%。而给药量为150mg/(kg·d)时,羟基自由基和超氧阴离子自由基的去除率可以分别达到10.0%和21.4%。巴斯德毕赤酵母甘露聚糖具有体外抗氧化活性,清除羟基自由基的EC5o为2.5mg/mL,同时可以有效抑制超氧阴离子自由基,且均有浓度依赖关系。本研究得到巴斯德毕赤酵母多糖提取分离的方法,该方法具有操作简单、产物纯度高、收率高的特点,获得的巴斯德毕赤酵母多糖显示出较好的免疫增强能力和抗氧化活性,具有作为保健品或药物预防和治疗人类重大疾病的潜力。本研究为巴斯德毕赤酵母中有效成分的高值化应用奠定了基础。