鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体的制备及快速检测方法的建立

论文摘要

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）是引起鸭传染性浆膜炎的病原菌,它主要侵害以水禽为主的多种家禽而引起急性或慢性传染病。发病病鸭常表现出嗜睡、歪颈、跛行、排黄绿稀粪,眼鼻有浆液性分泌物,随后出现痉挛、角弓反张等神经症状。以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎为其病变特征。鸭传染性浆膜炎病死率高,又可引起鸭生产性能降低,且治疗费用较高,可造成较高的经济损失。因此如何准确、快速的诊断成为防治该病的关键。本研究利用全菌免疫法研制了针对鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体,并建立了检测鸭疫里默氏杆菌的双抗体夹心ELISA方法、免疫胶体金方法和PCR检测方法,为该病的快速检测和疾病控制提供了有力的技术支撑。1、鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体的制备本研究利用RA全菌作为免疫原,用弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,2周、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；6周后不加佐剂,取相同剂量抗原腹腔注射小鼠,最后一次免疫3天后取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得RA单克隆抗体杂交瘤细胞株共四株,分别命名为2F7、3C9、5G7和2E6。单抗2F7的亚类为IgG2b,单抗2E6、5G7、3C9为IgG3。这四种单抗与鸭源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌无交叉反应,具有良好的特异性,其中单抗5G7与已知血清型1、2、3、11型RA菌株反应,其他3株只与1、2、3型RA株反应。Western-blot结果显示单抗5G7可结合45KD左右蛋白条带。2、鸭疫里默氏杆菌快速检测方法的建立用血清1型RA菌株免疫兔制备RA的多抗血清,纯化单抗及多抗血清,用于建立双夹心ELISA。其中用多抗作为捕获抗体,单抗作为检测抗体,用184ng/孔纯化的多抗包被过夜；封闭液选择10%小牛血清37℃封闭2h；检测抗原、多抗、酶标抗体37℃作用1h；显色20min后用终止液终止,读取OD450,读值高于0.330且P/N>2.1,判定为阳性。所建立的双抗体ELISA方法与禽源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌无交叉反应,模拟样品的最低检测剂量为104CFU。以单抗5G7研制的免疫胶体金试纸条有良好的特异性,均不与巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌反应,与四个型的RA都反应。模拟样品的最低检出剂量为6×103CFU。根据16srDNA序列设计引物,扩增出384bp的目的条带,以此建立快速PCR的检测方法,该方法同样具有较好的特异性,与鸭源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌都不反应,而四种血清型的RA均可扩增出相应条带。模拟样品的最低检出细菌浓度200CFU,最低检测RA DNA含量20pg。在临床病料样品检测的结果显示PCR、双抗体夹心ELISA、免疫胶体金检测方法与传统细菌分离方法的阳性检出率分别为40.7%（11/27）、55.6%（15/27）、51.9%（14/27）、40.7%（11/27）。与细菌分离方法相比,三种方法的符合率分别为PCR92.6%、胶体金试纸法88.9%、双抗体夹心ELISA法为85.2%。因此本研究为临床与实践的不同需要提供了快速、特异、敏感的检测方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 综述：鸭疫里默氏杆菌研究进展
• 1 RA分子生物学研究进展
• 2 RA疫苗的研究进展
• 3 RA检测方法的研究进展
• 参考文献
• 第一章 鸭疫里默氏杆菌全菌单克隆抗体的制备
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4. 讨论
• 参考文献
• 第二章 鸭疫里默氏杆菌快速检测方法的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4. 讨论
• 参考文献
• 致谢