输血相关传染病病原体抗体检测蛋白芯片制备研究

论文摘要

蛋白质芯片,又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列（Protein microarray）,是指以蛋白质分子（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等）作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列;捕获能与之特异性结合的待测蛋白（存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等）。现行输血相关传染病传染病诊断检测手段主要是传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法,相对于蛋白芯片方法而言,此方法在总检测时间（Total time）、需要样品量（Amount of sample）、总操作步骤（Total steps）、同时检测样品数目（Number of samples in a detemination）、检出限（Limit of detection）五个方面均有一定不足,所以本着达到节省时间高通量高灵敏度的目的,本文通过将几种与输血相关传染病抗原蛋白制备蛋白芯片,通过检测从医院临床血清标本,建立一种以蛋白芯片方式为诊断检测途径的新方法。由于蛋白芯片技术现行发展可参考技术经验缺乏,本文旨在研究在蛋白芯片制备之前,建立初步模型,优化各种与成功制备相关条件,为输血相关传染病传染病诊断蛋白芯片进入中试打好基础。首先利用ELISA间接法建立初步模型,研究可行性;接下来其次利用纯化人IgG和人IgM为参考品优化调节模型蛋白芯片成功制备条件;最后利用已确定优化条件,将各种基因工程合成纯化抗原蛋白稀释成特定浓度,用ProSys 5510生物点样仪（美国Cartesian公司）点制芯片,以Express生物芯片扫描仪（美国Packard公司）扫描抗原抗体结合情况,Quant Analysis软件分析结果。研究结果如下:1.利用自行优化建立ELISA乙型肝炎病原蛋白微孔板孔,检测已收集临床血清（乙型肝炎阳性血清、健康体检血清）中相应抗体,本体系检测结果与ELISA确诊阳性、阴性检测结果符合率均达到82.5%;通过条件优化过程,得到与间接法成功检测相关抗体相关因素如下:抗原稀释倍数为500×、一抗待检血清稀释倍数为10×、标记二抗浓度为1000×、清洗次数为5×3（5min、3次）。2.成功制备蛋白芯片体系的优化条件以及标准曲线。点制温度为:22℃;湿度为:（RH）65%;点样用载体基片为:光学环氧基片（EPX）;点样液类型为:EPX对应B液;抗原蛋白稀释液为:碳酸盐缓冲液（CB）:封闭剂为:含1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）;封闭时间为:2h（37℃）;洗涤缓冲液为:含有0.05%Tween-20的PBST及PBS;洗涤次数:5min,3次（5×3）;一抗孵育时间为:30min（37℃）;二抗孵育时间为:30min（37℃）;标准曲线芯片成功制备,对待检血清中抗体可检测下限为0.05ng/nl。3.相关病原体抗原（纯化HBcAg、纯化HSVⅠ、纯化HSVⅡ、纯化CMV、纯化HIV1-2、纯化TP、纯化HCV、纯化TOX）抗体检测芯片成功制备。阴阳性符合率均达到75.74%;片内片间平均重复率84.05%;平均灵敏度:一抗稀释度100×,达到0.1ng/nl;平均特异性84.5%;稳定保存可达12weeks。本芯片体系初步建立输血相关传染病病原体抗体检测芯片,如能再扩大临床血检验力度,通过大样本实验,调节各个影响因素,继续加以改进发展。使得此方法体系更加稳定,以期能够应用于临床检验,替代耗时费力的ELISA试剂盒传统方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 生物芯片
• 1.2 蛋白质芯片
• 1.2.1 蛋白芯片概述
• 1.2.2 蛋白芯片主要类型
• 1.3 蛋白芯片方法在相关传染病中诊断应再研究
• 1.3.1 相关传染病概述
• 1.3.2 ELISA方法在血液传染病诊断检测方面应用
• 1.3.3 蛋白芯片在传染病诊断的方面的进展
• 1.4 本文研究内容
• 1.5 研究目的
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 主要耗材
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要溶液
• 2.1.5 标本
• 2.2 方法
• 2.2.1 经典ELISA方法建立可行性模型
• 2.2.2 蛋白芯片方法学研究
• 2.2.3 输血相关传染病抗体芯片建立
• 3 结果与分析
• 3.1 经典ELISA方法初步建立可行性模型
• 3.1.1 最佳反应条件确定结果
• 3.1.2 确定阳性血清待检稀释倍数
• 3.1.3 本体系ELISA方法符合率
• 3.2 蛋白芯片方法学初步建立
• 3.2.1 载体选择
• 3.2.2 点样液以及点样缓冲液选择
• 3.2.3 环境因素以及机械因素确定
• 3.2.4 蛋白芯片应条件优化
• 3.2.5 标准曲线制备
• 3.3 输血相关传染病抗体检测芯片建立
• 3.3.1 抗体检测芯片制备
• 3.3.2 确定一抗浓度及二抗浓度
• 3.3.3 阳性临床样本的初步检测结果
• 4 讨论
• 1.经典ELISA方法初步建立可行性模型
• 2.蛋白芯片成功制备条件优化
• 3.相关病原体蛋白芯片建立
• 4.意义
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间研究成果