空心莲子草几丁质酶分离纯化及其抗逆相关性研究

论文摘要

苋科莲子属多年生草本植物空心莲子草（Alternathera philoxeroides）因其强抗逆性而迅速蔓延,成为有害杂草,严重破坏生态环境,影响农、牧、渔生产。对该杂草的治理一直是各国政府的工作重点。但虽曾大力推行化学和生物防治,却没有收到预期效果,危害仍很严重。植物病程相关蛋白（Pathogenesis-related protein,PRs）是植物体内的一类功能蛋白。植物病原物及各种环境胁迫因子均会引起病程相关蛋白增加,进而提高植物防御能力。大量研究表明,几丁质酶（Chitinase）作为重要的病程相关蛋白,参与不同植物的多种胁迫反应。因此本研究将（一）观察不同胁迫条件下,空心莲子草内几丁质酶的变化规律;（二）提取分离空心莲子草几丁质酶; （三）研究空心莲子草几丁质酶的酶学性质,以研究该植物的抗逆机制,掌握其抗逆薄弱环节,为其有效防治提供新的思路,为化学和生物防治的最佳时机选择提供理论依据。研究结果如下:一、不同胁迫条件下,空心莲子草几丁质酶有不同的变化规律。不同浓度壳聚糖、NaCl、乙烯利处理及机械损伤均能引起空心莲子草叶片几丁质酶活性增加。其中植物对乙烯利的反应最为迅速,如0.1 mg·ml﹣1及0.2 mg·ml﹣1乙烯利处理1天后,几丁质酶活力就显著高于对照组（p<0.01）,在第2、3天时,酶活力仍很高（p<0.01）,到第4天时,才回落到对照水平;其次,空心莲子草对壳聚糖的反应也较快,0.1%壳聚糖处理后第2～5天、0.2%壳聚糖处理后第2～4天及0.4%壳聚糖处理后第2～3天后,叶片几丁质酶活力均显著增加（p<0.05）;同样,机械损伤3天后,空心莲子草叶片中的几丁质酶比活力比对照组增加2倍多（p<0.01）。相比之下,空心莲子草对盐胁迫较不敏感,只有1%NaCl处理第8天后,几丁质酶活力才明显增加（p<0.01）。二、空心莲子草几丁质酶具特殊的酶学性质。空心莲子草通过研磨、（NH4）2SO4分级沉淀法（确定40%～60%为最佳饱和硫酸铵浓度区间）、Sephadex G-75凝胶层析、DEAE- Sepharose Fast flow离子交换层析及Sephadex G-100凝胶层析等纯化步骤,分离出几丁质酶。经SDS-PAGE检测为单一蛋白条带,测定分子量约为45kDa。纯酶比活力为39.77U·mg﹣1,纯化倍数为26.17。该几丁质酶最适反应温度60℃,最适反应pH为5.7,在pH4.0～8.0时比较稳定。当pH小于4.0和大于8.0时酶活力丧失50%以上,在pH2.0和10.0处无活力,当温度高于80℃,酶稳定性下降明显。该酶对胶状几丁质的km值为0.58mg·ml﹣1。结果表明,几丁质酶参与空心莲子草对壳聚糖、乙烯利及机械损伤等因子的胁迫应答,它的高温耐受性可能是该植物具有强抗逆性的原因之一。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 中英文对照
• 前言
• 1 空心莲子草
• 1.1 空心莲子草危害
• 1.2 空心莲子草抗逆性
• 1.3 空心莲子草的防治进展
• 2 植物几丁质酶——病程相关蛋白
• 2.1 病程相关蛋白
• 2.2 几丁质酶概述
• 2.2.1 几丁质酶水解底物——几丁质
• 2.2.2 几丁质酶研究历史
• 2.2.3 植物几丁质酶性质与结构
• 2.2.4 几丁质酶的分类与催化机制
• 2.2.5 植物几丁质酶的生物学功能
• 2.2.5.1 几丁质酶抗逆作用
• 2.2.5.2 几丁质酶参与共同固氮作用
• 2.2.5.3 几丁质酶作用存在剂量效应
• 2.2.6 几丁质酶分子水平研究
• 本实验研究意义
• 正文
• 1. 材料
• 1.1 实验仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验试剂配制
• 1.4 实验材料
• 2. 方法
• 2.1 实验材料处理方法
• 2.2 几丁质酶的提取
• 2.3 胶状几丁质的制备
• 2.4 几丁质酶活力测定方法
• 2.5 蛋白质含量的测定
• 2.6 硫酸铵分级沉淀
• 2.7 透析
• 2.8 葡聚糖凝胶层析
• 2.9 离子交换层析
• 2.10 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.11 酶学性质研究
• 3. 结果
• 3.1 空心莲子草几丁质酶对不同胁迫的应答
• 3.1.1 空心莲子草几丁质酶对 NaCl 胁迫的应答
• 3.1.2 空心莲子草几丁质酶对机械损伤的应答
• 3.1.3 空心莲子草几丁质酶对壳聚糖溶液胁迫的应答
• 3.1.4 空心莲子草几丁质酶对乙烯胁迫的应答
• 3.2 几丁质酶提取分离
• 3.2.1 最佳硫酸铵饱和度确定
• 3.2.2 Sephadex G-75 葡聚糖凝胶过滤
• 3.2.3 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析过滤
• 3.2.4 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶过滤
• 3.2.5 几丁质酶的电泳分析
• 3.2.6 几丁质酶纯化倍数表
• 3.3 几丁质酶酶学性质研究
• 3.3.1 最适反应pH
• 3.3.2 pH 稳定性
• 3.3.3 最适反应温度
• 3.3.4 温度稳定性
• 3.3.5 Km 值的测定
• 4. 讨论
• 4.1 空心莲子草几丁质酶对不同胁迫的应答
• 4.2 空心莲子草几丁质酶的分离及性质测定
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表论文