超氧阴离子及过氧化氢对在体大鼠肠系膜微血管通透性的作用

论文摘要

氧化应激过程中活性氧（ROS）的产生是包括心血管疾病在内的很多疾病发病或导致疾病加重的主要因素。作为心血管系统的第一道屏障,血管内皮细胞易受活性氧影响出现功能失常或通透性增加,但ROS对在体微血管通透性影响及其具体机制尚不清楚。目的:本研究采用在体大鼠肠系膜微血管灌注的方法,观察了中性粒细胞释放ROS及外源性给予过氧化氢或超氧阴离子对微血管通透性、内皮细胞钙离子浓度、一氧化氮产生、细胞骨架蛋白、细胞粘附连接的影响,以初步研究超氧阴离子及过氧化氢增加血管通透性的机制。方法:fMLP刺激中性粒细胞悬液ROS的释放通过测量化学发光进行定量。通过测定在体大鼠肠系膜微血管静水传导性观察微血管通透性变化。采用钙荧光指示剂（Fura 2-AM）、NO荧光指示剂（DAF-2 DA）标记在体微血管内皮细胞,并应用荧光显微镜检测细胞内钙或NO的荧光信号,观察ROS对内皮细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)、NO的影响。通过激光共聚焦显微镜用免疫荧光染色的方法观察超氧阴离子或过氧化氢作用下,内皮细胞F-肌动蛋白、VE-Cadherin的变化。结果:1.中性粒细胞释放的ROS对在体大鼠微血管内皮细胞通透性的影响fMLP（10μM）作用于中性粒细胞悬液（2×106个细胞/ml）可迅速增加化学发光值,由90.1±22.1 RLU增至峰值617.4±32.7 RLU（P＜0.01）。同时,微血管灌注fMLP刺激的中性粒细胞悬液也可一过性增加微血管通透性至正常对照的3.6±0.6倍（P＜0.01）,同时增加内皮细胞[Ca2+]i,由90.44±6.17 nM增至峰值浓度296.87±10.61 nM。而单独灌注fMLP对微血管通透性及内皮细胞[Ca2+]i无影响。使用SOD（1500 U/ml）可抑制中性粒细胞ROS释放所致微血管通透性变化及内皮细胞[Ca2+]i的增加。2.超氧阴离子和过氧化氢对在体大鼠微血管内皮细胞通透性的影响:通过微血管灌注次黄嘌呤（0.5 mM）及黄嘌呤氧化酶（10 mU/ml）以产生超氧阴离子可迅速一过性增加微血管通透性,在给药5 min内达到峰值,为正常对照的3.8±0.3倍（P＜0.01）。与超氧阴离子不同,过氧化氢可缓慢地持续地增加微血管通透性。过氧化氢（100、500μM）灌注15 min对微血管通透性无影响。500μM过氧化氢灌注30 min可增加微血管通透性至正常对照的4.02±0.59倍（P＜0.01）。100μM及500μM过氧化氢灌注60 min可增加微血管通透性至正常对照的6.13±0.87倍及12.65±3.68倍（P＜0.01,P＜0.05）。3.超氧阴离子和过氧化氢对在体大鼠微血管内皮细胞钙的影响超氧阴离子可一过性增加内皮细胞[Ca2+]i,由105.80±5.60 nM升至峰值浓度397.20±80.01 nM（P＜0.01）。过氧化氢（100μM）可缓慢地持续性地增加微血管内皮细胞[Ca2+]i。灌注过氧化氢15 min、30 min、60 min,内皮细胞[Ca2+]i分别为154.50±13.11,231.33±31.64,714.58±144.70 nM（P＜0.01）。Ca2+通道阻滞剂氯化镧（50μM）可抑制超氧阴离子及过氧化氢所引起的微血管通透性增加及内皮细胞[Ca2+]i升高。4.超氧阴离子和过氧化氢对在体大鼠微血管内皮细胞内NO产生的影响超氧阴离子及过氧化氢均可迅速增加内皮细胞NO的产生,最高值分别为正常对照的254.9%±44.2%、1034.3%±44.3%（P＜0.05,P＜0.01）。NOS抑制剂L-NAME、AP-Cav-1可抑制超氧阴离子及过氧化氢所引起的微血管通透性增加。AP-Cav-1对超氧阴离子及过氧化氢的Ca2+增加作用无抑制作用。5.超氧阴离子和过氧化氢对在体大鼠微血管内皮细胞细胞骨架和粘附连接的影响超氧阴离子或过氧化氢作用可引起血管内皮细胞F-肌动蛋白形态及分布发生变化,细胞F-肌动蛋白分布紊乱不规则,细胞内部有密集的应力纤维形成。并改变内皮细胞VE-Cadherin正常结构,导致粘附连接断裂,细胞间裂隙形成。结论:1.fMLP刺激中性粒细胞释放超氧阴离子可增加大鼠微血管通透性及内皮细胞[Ca2+]i。2.黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤所产生的超氧阴离子可一过性增加微血管通透性,而过氧化氢可导致微血管通透性持续性增加。3.超氧阴离子可一过性增加内皮细胞[Ca2+]i,而过氧化氢可持续性增加微血管内皮细胞[Ca2+]i。阻断钙内流可抑制超氧阴离子及过氧化氢所引起的通透性变化。提示超氧阴离子及过氧化氢所致的通透性增加与细胞内Ca2+增加有关。4.超氧阴离子及过氧化氢可增加内皮细胞内NO的产生。一氧化氮合酶抑制剂可抑制超氧阴离子及过氧化氢所致通透性增加。提示超氧阴离子及过氧化氢所致血管通透性增加与NO增加有关。5.超氧阴离子及过氧化氢可引起内皮细胞F-肌动蛋白重组,形成应力纤维;并改变内皮细胞VE-Cadherin正常结构,导致粘附连接断裂,细胞间裂隙形成。血管通透性增加可能与此结构变化有关。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 第一部分 中性粒细胞释放的活性氧对大鼠微血管内皮细胞通透性的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 超氧阴离子和过氧化氢对大鼠在体微血管内皮细胞通透性的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 超氧阴离子和过氧化氢对在体大鼠微血管内皮细胞内钙离子浓度的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第四部分 超氧阴离子和过氧化氢对在体大鼠微血管内皮细胞内NO产生的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第五部分 超氧阴离子和过氧化氢对在体大鼠微血管内皮细胞细胞骨架和粘附连接的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 血管内皮细胞糖萼与心血管疾病
• 综述参考文献
• 致谢