颈椎动力失衡与黄韧带退变的相关性研究

论文摘要

目的:颈椎黄韧带退行性变（degeneration of the ligamentum flavum,DLF）表现为黄韧带的增生、肥厚和骨化,黄韧带的退变导致其弹性下降,预张力的作用丧失,当脊柱后伸时,颈椎黄韧带不是缩短,而是出现皱褶或折叠而凸入椎管,使椎管容量明显减小,以致压迫颈髓及神经根,尤其在合并颈椎间盘突出或关节突增生肥大时,可使颈椎管的有效空间进一步减小,从而引起一系列颈椎疾患,如颈椎管狭窄症、颈椎病、颈椎黄韧带叠压症等,出现相应的临床症状。随着社会进入老龄化阶段,黄韧带退变所引起的疾病越来越常见,这些疾病往往需要手术治疗,而许多情况下手术又具有一定的风险,如胸椎黄韧带骨化造成的椎管狭窄,手术容易出现截瘫等并发症,另外,椎管的狭窄绝大多数发生在盘-黄间隙（interdiscoligamentous space）水平,这也是神经受压最常见的部位,因此,如何预防或延迟黄韧带肥厚、退变的发生是非常重要的,这一问题也越来越受到国内外学者的高度重视。Sairyo K等人认为黄韧带的纤维化是黄韧带肥厚的主要原因,随着年龄的增长,累积的机械应力的增加是造成黄韧带纤维化（fibrosis）的主要原因,特别是背侧面（dorsal aspect）的黄韧带受到牵拉刺激后,其纤维化程度更为明显。而且发现在黄韧带中有炎症反应相关基因（inflammation-related gene）的表达。VonMisses等的研究也显示,位于背侧的黄韧带纤维比两端的黄韧带受到较高的应力。我们前期的研究发现转化生长因子-β1、骨形态发生蛋白-2在黄韧带退变早期阶段对黄韧带的退变具有重要的调节作用,转化生长因子-β1可刺激间质纤维化,尤其是在黄韧带肥厚早期阶段。目前对于黄韧带纤维化及黄韧带肥厚分子水平的发生机制尚不清楚,黄韧带退变的始动因素还未见报道,这些问题的解决必须建立在对DLF发病机制清晰了解的基础上,因此,建立合理的实验动物模型,从多角度对颈椎黄韧带退变的发生机制进行研究是非常必要的。有学者通过临床观察发现,黄韧带肥厚病人80%以上长期从事体力劳动,脊柱后凸患者中60%发生了韧带的肥厚,说明脊柱的前屈导致局部黄韧带所承受的牵张力增高,在黄韧带退行性变中起了重要的作用。因此,本研究应用颈后肌肉切除的方法建立起颈椎动力平衡失调大鼠黄韧带退变动物模型,应用投射电镜、免疫组织化学、分子生物学等方法,观察动力失衡大鼠黄韧带早期（2月内）变化规律,并与对照组、肌肉剥离组黄韧带标本进行对照研究,从多个角度探索颈椎动力失衡对颈椎黄韧带退性形变的影响。方法:选择2月龄的清洁级Wistar健康雄性大鼠120只,重量195-215g,随机分为3组,A组为颈后肌肉切除组,B组为颈后肌肉剥离组,C组为对照组。颈后肌肉切除组:取颈部后正中切口,长2～3cm,切开皮肤、皮下组织,止血,沿棘突及双侧椎板向两侧剥离椎旁肌,上下剥离范围为2cm,横向分别切断浅层的颈阔肌、颈斜方肌、头颈菱形肌及深层的颈夹肌、头、颈、寰最长肌、颈髂肋肌、头半棘肌,并切除1.5cm长一段,防止断端愈合,逐层缝合切口。颈后肌肉剥离组:取颈部后正中切口,长2～3cm,切开皮肤、皮下组织,止血,沿棘突及双侧椎板向两侧剥离椎旁肌,上下剥离范围为2cm,逐层缝合切口。对照组:取颈部后正中切口,长2～3cm,切开皮肤、皮下组织,缝合切口。术后15天、术后30天、术后60天,各组取实验动物8只,拍摄颈椎正、侧位CR片。运动功能评价:各组大鼠单笼自由放养,分别于术后3d、5d、15d、30d、60d对各组动物进行运动功能评价,实验中将大鼠身体纵轴与斜板纵轴一致,分别采用大鼠头高位和头低位,测试大鼠能够停留在橡胶斜板上10秒的斜板最大倾斜角度,取两个角度的平均值作为大鼠斜板实验值,本方法参考宋沛松的方法并稍加改进。术后3d、5d、15d、30d、60d共五个时间点取材。每个时间点每组取3只大鼠,甲醛灌注处理后,显微镜下取出其颈5～6、颈6～7椎板间隙黄韧带,置于小标本瓶内预冷的戊二醛固定液中,4℃保存,超薄切片,电镜观察。每个时间点取大鼠5只,将所取得的标本切片,苏木精-伊红（H.E）染色,光镜下观察病理变化;ABC法染色,光镜下观察黄韧带组织内内源性肿瘤坏死因子α（tumornecrosis factor-α,TNF-α）表达情况;按TRIzol Reagent说明书提取总RNA,检测RNA完整性,以randerm primer为引物合成cDNA,将PCR产物进行纯化、检测,将TNF-αmRNA PCR产物的灰密度值与管家基因β-actin的灰密度值之比作为TNF-αmRNA相对含量,为TNF-α的半定量值,观察内源性TNF-α在颈椎动力失衡大鼠黄韧带中的表达水平。结果:1.X-线检查:肌肉切除组:术后15天CR显示大鼠颈椎生理屈度自然,椎间隙无狭窄,无骨赘形成。术后30天,大鼠颈椎生理屈度与术后15天相比变化不大,个别大鼠椎间隙略狭窄,未见明显骨赘形成。术后60天,大鼠颈椎生理屈度变化仍然不大,但出现颈椎间隙变狭窄,椎体前缘轻度骨质增生,关节突间关节及钩椎关节有硬化表现;肌肉剥离组与对照组术后15天、术后30天及术后60天时的CR表现未见明显异常改变。2.运动功能评价:术后3天、5天,肌肉切除组较肌肉剥离组、对照组功能角度明显降低p*＜0.01,差异有显著性,术后15天,差异仍然有显著性,p*+＜0.05,而术后30天及术后60天,肌肉切除组与B、C两组同时间相比,差异无显著性,p**＞0.05。3.超微结构观察:正常对照组:各时间点变化不大,表现为纤维细胞数量少,胞浆少,胞核细长,细胞器数量少,线粒体呈幼稚状态,线粒体嵴显示不清;弹力纤维排列规则、致密,纤维横纹规律,明暗带相间排列,暗带间距离相等;可清楚显示出纤维束呈波浪状排列。肌肉切除组:3天时,出现大量的成纤维细胞,细胞粗短,胞浆丰富,内质网增大、增粗,排列规则,线粒体数量多,嵴突起,体积大,部分内外膜不完整,呈代谢活跃状态,胞内散在高电子密度颗粒,成纤维细胞周围有新形成的少量胶原纤维,排列紊乱。弹力纤维粗细均匀,排列规整,有明显规律的周期性明暗带,但弹力纤维较正常对照组略变粗,纤维间质成分增多。5天时,成纤维细胞数量较3天时有所减少,细胞外观仍粗短,胞浆丰富,内质网形态规则,线粒体数量较多,嵴突起,内外膜不完整,呈代谢活跃状态,成纤维细胞周围新形成的胶原纤维明显增多,排列紊乱;弹力纤维排列仍规整,明暗带周期性条纹规律,纤维较正常对照组仍略粗。15天时,成纤维细胞数量减少,细胞变得细长,但胞质仍较丰富,细胞器数量下降,线粒体内嵴显示不清晰,表现为功能下降状态,细胞周围新形成的胶原纤维较5天时明显增多,结构致密,粗大,纤维排列较紊乱,明带与暗带排列不规整,间距不等;弹性纤维间隙增宽,纤维间隙内有较多的基质成分。30天时,成纤维细胞数量减少,细胞细长,胞核染色深,胞浆量少,细胞器进一步变少、浓缩,线粒体嵴不易分辨,许多视野中见不到成纤维细胞。细胞周围新形成的胶原纤维粗细不等,但可见清晰的明暗交替的带状条纹,排列较规整。纤维束粗大呈波浪状。60天时,成纤维细胞数量及形态接近纤维细胞,胞浆及细胞器明显减少,纤维束排列规整,较正常对照组明显粗大,纤维间隙内仍有较多的基质成分。肌肉剥离组:各时间点纤维细胞数量少,胞体细长,细胞质少,线粒体数量少,内质网稀疏呈泡状。弹性纤维排列致密、规则,明暗带相间排列,暗带间距相等;能清楚显示出纤维束呈波浪状排列。未见明显的弹力纤维断裂等情况,与正常大鼠黄韧带超微结构相似。4.HE染色结果:大鼠颈椎黄韧带组织中主要成分是纤维组织,胶原纤维呈淡粉红色,弹力纤维呈亮粉红色,二者不易区分,黄韧带纤维间有少量的纤维细胞。肌肉切除组:3天时韧带组织内成纤维细胞数目明显增多,胞核呈圆形、椭圆形,周围纤维组织稀少;术后5天,韧带组织内成纤维细胞数目仍然较多,胞核略细长呈椭圆形,周围纤维组织疏松稀少;术后15天,纤维组织逐渐增加;术后30天可见成纤维细胞被染成深褐色,数量较多,呈长梭形,周围有大量肥厚的纤维组织,纤维束排列紊乱,分布不均匀;术后60天,纤维束明显肥厚、增粗,排列紊乱,缺乏规律性波浪状走行。对照组及肌肉剥离组:术后各时间点组织学变化不大,均可见纤维组织排列规整,呈明显波浪状排列,无明显纤维束断裂等情况,黄韧带纤维间有少量的纤维细胞。5.免疫组织化学染色:免疫组化染色显示,各组中黄韧带的纤维组织中TNF-α多无阳性表达,染色不明显,因此大部分显示不清晰,而只有组织染色阳性的部位组织结构显示清晰。肌肉切除组:术后3天出现黄韧带强阳性表达,成纤维细胞数量增多,细胞胞浆及胞膜呈浅黄色或棕黄色,细胞间质及纤维组织内无明显表达;术后5天时TNF-α表达最强,胞浆呈棕褐色,细胞间质呈阳性表达;术后15天表达开始减弱,胞浆呈棕黄色,细胞间质有局灶性淡染区;术后30天表达较15天时减弱,胞浆呈浅黄色,细胞间质偶有淡染区;术后60天,成纤维细胞变细长,已表现为纤维细胞形态,部分成纤维细胞胞浆内仍有淡黄色表达,细胞间质内无明显阳性表达。肌肉剥离组及对照组:未见TNF-α明显的阳性表达。6.RT-PCR:经琼脂糖凝胶电泳可见到TNF-α的RT-PCR产物为363bp,经DNA测序证明片段为TNF-α。组内比较:颈后肌肉切除组:术后3天可见到TNF-αmRNA的表达,5天时达到高峰,15天、30天、60天时依次逐渐下降,3天、5天时TNF-αmRNA的表达较后三个时间点明显为高。肌肉剥离组和对照组:组内各时间点表达均较弱,差异无统计学意义。组间比较:颈后肌肉切除组与肌肉剥离组和对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）,肌肉剥离组和对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:1.Wistar大鼠黄韧带的结构和功能接近人类,切除颈后方的肌肉,大鼠出现了低头行走的异常行为模式,颈椎黄韧带受到了过度牵拉刺激,成功建立起动力失衡性大鼠颈椎动物模型,本实验模型对研究黄韧带退变简单、易行,是目前研究黄韧带退变较理想的动物模型,这与人类长期低头工作造成的颈椎退行性变,最终形成颈椎病的情况十分相似。2.大鼠颈后方肌肉再生能力较强,术后二个月,大鼠步态完全正常,能够正常觅食,因此,本动物模型最为适合于观察颈椎动力失衡早期对黄韧带的影响,是否适合于观察长期颈椎动力失衡对黄韧带的影响尚需进一步研究。3.大鼠颈椎动力失衡X线早期表现为颈椎间隙的变窄,关节突间关节硬化,而颈椎生理屈度的变化出现较晚;颈椎后方肌肉切除造成的颈椎动力失衡,可以明显加速黄韧带纤维组织的增生、排列紊乱,黄韧带发生肥厚、退变。4.颈后肌肉切除术后早期,黄韧带中成纤维细胞数量增多,细胞周围新形成少量排列紊乱的胶原纤维。随着时间的延长,成纤维细胞逐渐向纤维细胞转化,细胞周围胶原纤维不断增多,术后二个月,成纤维细胞形态接近纤维细胞,数量减少,纤维束排列规整、粗大,纤维间隙内仍有较多的基质成分。5.大鼠颈后方肌肉切除术后各时间点黄韧带中都有TNF-α的阳性表达,3天、5天时表达明显,术后30天,其表达水平有下降趋势。6.颈后肌肉剥离及对照组大鼠黄韧带中,TNF-α的表达水平非常低,在免疫组织化学检测中未能看到阳性表达,而在RT-PCR法可以测到弱阳性表达,与肌肉切除组大鼠比较,差异有非常显著性意义。7.大鼠颈椎动力失衡可以使黄韧带中TNF-α的表达明显增强,内源性TNF-α可能在黄韧带的退变过程中具有重要调节作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词
• 第一部分 动力失衡性大鼠颈椎黄韧带退变模型的建立
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图表
• 参考文献
• 第二部分 退变早期黄韧带超微结构的实验研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图表
• 参考文献
• 第三部分 颈椎动力失衡早期黄韧带中TNF-α的基因表达
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图表
• 参考文献
• 全文小结
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表论文及编写论著一览表
• 学位论文评阅及答辩情况表
• The Expression of TGF β1 and BMP-2 in the Experimental Ligamentum Flavum of the Unstable Cervical Spine
• Mechanical Mechanism and Relative Problems of Lumbar Traction