阪崎肠杆菌检验、分型和16S rDNA序列分析的研究

论文摘要

婴幼儿配方粉中阪崎肠杆菌的食品安全问题成为近几年国际关注的新焦点。然而，由于对阪崎肠杆菌的早期研究较少，针对该菌的检验和分型方法等技术都尚不充分和完善。2004年起本实验室开始进行阪崎肠杆菌的系统研究，并着手建立相应的检验方法、污染状况调查、分型技术和溯源数据库，本研究开展了以下四方面的工作：1．阪崎肠杆菌检验方法的建立和污染状况的调查在研究中，我们分别以美国FDA方法和ISO方法为基础，建立了配方粉中阪崎肠杆菌的FDA定性检测方法（第一法）和ISO定性检测方法（第二法）。为了进一步对上述两种方法进行比较和分析，2005年我们同时采用两种方法对收集到的194份市售配方粉进行了定性检测。经过选择性增菌和分离，第二法中有待生化鉴定的阪崎肠杆菌疑似菌落只有8个，明显少于第一法，而且其特征性菌落易于辨认。运用两种方法分别检测到4个和5个阳性样品，其中第二法检出的1个阳性样品在第一法中未检出。第二法中的选择性增菌液肉汤mlST-Vm和阪崎肠杆菌显色培养基的选择性明显优于第一法中相应的培养基，可以大大减少工作量，简单省时。在本试验室研究的基础上，我们根据ISO和美国FDA的阪崎肠杆菌检测方法，通过大量的比对和实验研究建立阪崎肠杆菌定性和定量检测方法，形成《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验》标准文本，通过专家认可，形成报批稿，报送国家标准化管理委员会。为了加强即将颁布的“食品卫生微生物学检验”国家标准的全面实施，在2006年和2007年开展的食品卫生微生物学相关食源性致病菌检验两次培训的基础上，为进一步了解市售配方粉中阪崎肠杆菌的污染情况、检验各监测点对阪崎肠杆菌检验的应用能力，2007年组织国家食源性疾病监测网的20个省／直辖市，采用本研究中建立的阪崎肠杆菌检验方法，进行婴儿配方粉中阪崎肠杆菌污染的调查。共采集630份婴儿食品，其中从610份配方粉检出阳性样品10份，占1．64％；从一份米粉样品中检出阪崎肠杆菌污染；福建、甘肃、湖南、吉林、内蒙古、宁夏、陕西等7个监测点检出阪崎肠杆菌阳性样品。虽然在过去的几年中整个婴幼儿配方粉市场已经得到良好的管理和改善，但仍不能完全排除该类产品中阪崎肠杆菌污染问题。加强婴儿食品生产过程和终产品中阪崎肠杆菌污染的监控，是各生产企业提高产品卫生质量的必要手段和措施。调查和研究我国市售配方粉中阪崎肠杆菌和其他肠杆菌的污染状况。采用传统的微生物学分离和鉴定方法检测212份市售配方粉中阪崎肠杆菌和其他肠杆菌。整个试验包括无菌水增菌培养、EE肉汤选择性增菌、VRBGA平板选择性分离、TSA平板分离培养和生化鉴定。从11份样品中分离到阪崎肠杆菌，占总样品的5．19％。从48．58％的样品中检出肠杆菌，其中常见的肠杆菌包括：泛菌属某些种、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、醋酸钙-鲍曼复合不动杆菌、阪崎肠杆菌、非脱羧勒克氏菌、伤口埃希氏菌和大肠埃希氏菌等。配方粉中肠杆菌的污染可能会导致食用者，尤其是婴儿的严重感染，本研究中的调查结果有助于针对市售配方粉实施有效的卫生预防和控制措施。2．阪崎肠杆菌分型方法的研究使用商品化的生化鉴定系统对2株阪崎肠杆菌标准株和29株食品分离株进行生物分型。API 20E和VITEK GNI+将31株阪崎肠杆菌分别分为5个和15个生化类型。与API 20E生物分型相比，拥有30个生化反应的VITEK GNI+的分辨度更高。同时使用较多的生化反应可对细菌进行一定程度的分型，然而，由于细菌易受环境因素影响而改变其性状的表达，源于同一亲代的菌株在表型上可有所不同，这时采用生物分型的方法可能无法对其进行正确分型。利用CLSI推荐的肉汤微量稀释法对2株阪崎肠杆菌标准株和29株食品分离株的抗生素敏感性进行测定。结果发现，所有菌株对测定的16种抗生素均无耐药，只有ES 002、ES 010、ES 011、ES 026四种分离株的链霉素抗生素敏感性处于“中介”，其他菌株对测定的抗生素均敏感。鉴于阪崎肠杆菌食品分离株的抗生素敏感性较高，抗生素敏感性分型不能作为一种行之有效的分型方法。对2株阪崎肠杆菌标准株和29株食品分离株进行脉冲场凝胶电泳分型研究。分别利用限制性内切酶XbaⅠ和SpeⅠ酶切阪崎肠杆菌染色体DNA并进行PFGE分析，利用BioNumerics软件进行聚类分析。31株阪崎肠杆菌使用XbaⅠ和SpeⅠ酶切分别有30种PFGE带型。除ES 004和ES 005外，其他29株阪崎肠杆菌经XbaⅠ或SpeⅠ酶切后的PFGE条带之间均存在不同程度的差异。来源于同品牌同批次不同包装的产品中的ES 004和ES 005分离株XbaⅠ和SpeⅠ酶切图谱完全一致（相似度为100％）。根据BioNumerics软件分析结果可知，除分离株ES 004和ES 005外，其他分离株的带型和样品来源之间无显著相关性。虽然XbaⅠ酶切的PFGE带型平均条带少于SpeⅠ，但对阪崎肠杆菌具有足够的分辨度。两种PFGE分型方法都可应用于阪崎肠杆菌的分子分型和溯源。对2株阪崎肠杆菌标准株和29株食品分离株进行核糖体分型研究。采用DuPont RiboprinterTM系统对31株阪崎肠杆菌进行自动化核糖体分型，利用BioNumerics软件进行聚类分析，并与PFGE方法进行比较。DuPont RiboprinterTM将31株阪崎肠杆菌分为27种带型，其分辨度明显低于PFGE分型方法。采用BioNumerics数据库软件，结合样品的来源信息，对29株阪崎肠杆菌分离株的带型进行分析，除来自同品牌同批次不同包装的产品ES 004和ES 005分离株的指纹图谱完全一致外，其他分离株的带型和样品来源之间无显著相关性。总之，PFGE是分辨度最高的阪崎肠杆菌分型方法，其次是核糖体分型、生物分型和抗生素敏感性分型。3．阪崎肠杆菌分离株16S rDNA序列分析对2株阪崎肠杆菌标准株和29株食品分离株的16S rDNA进行测序。通过对所研究的16S rDNA序列的多重对比分析和系统发育学分析发现，除ATCC51329和ES 014外，其他阪崎肠杆菌与ATCC 29544的16S rDNA序列均属于同一基因群，而ATCC51329和ES 014分别属于另外一个分支。从BioNumerics相似度矩阵可以看出，ES 001和ES 016与标准株ATCC29544的相似度最高，达99．97％；ES 004、ES 005和ES 019的相似度为1 00％；ES 021和ES 029的相似度为100％，然而，除ES 004和ES 005外，其他菌株在来源上无相关关系。从16S rDNA序列分析可知，除ES 014不能确定外，本研究中的所有阪崎肠杆菌分离株均可从基因水平上得到准确鉴定。4．阪崎肠杆菌溯源数据库采用BioNumerics数据库软件，建立比较完整的阪崎肠杆菌（表型分型、分子分型和16S rDNA序列）溯源数据库。利用该数据库的技术基础和不断完善的数据信息，将对阪崎肠杆菌食源性疾病的散发、暴发及常规监测中的追踪和溯源等提供有效的技术依据。利用建立的阪崎肠杆菌溯源数据库对本研究中的2株阪崎肠杆菌标准株和29株食品分离株进行综合分析，发现除ES 004和ES 005之外，无原料来源等其他流行病学资料，不能证明其菌株来源之间存在显著相关关系；PFGE分型方法是一项较为实用且准确的阪崎肠杆菌分子分型方法；在阪崎肠杆菌溯源的实践中，必须根据其他流行病学资料和两种以上的分型方法进行合理的解释。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 英文缩略词
• 第一部分 阪崎肠杆菌检验方法的研究和污染状况的调查
• 一、阪崎肠杆菌检验方法的建立和标准化
• 研究背景
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 二、2007年国家食源性疾病监测网婴儿配方粉中阪崎肠杆菌污染状况的调查
• 1 材料和方法
• 2 结果和讨论
• 三、中国市售配方粉中阪崎肠杆菌和其他肠杆菌的污染状况
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 小结
• 第二部分 阪崎肠杆菌分型方法的研究
• 一、生物分型
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 小结
• 二、抗生素敏感性分型
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 小结
• 三、脉冲场凝胶电泳分型
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 小结
• 四、核糖体分型
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 小结
• 第三部分 阪崎肠杆菌分离株16SrDNA序列分析
• 一、基因组DNA的获得
• 二、16S rDNA片段的获得
• 三、PCR产物测序和分析
• 小结
• 第四部分 阪崎肠杆菌溯源数据库
• 一、阪崎肠杆菌溯源数据库的建立
• 二、阪崎肠杆菌溯源数据库的分析
• 小结
• 总结
• 附录A:培养基成分和制法
• 附录B:试剂成分和制法
• 发表文章
• 参考文献
• 致谢