论文摘要
生物大分子的结构解析一直以来都是生命科研一个重要研究领域。一方面通过对生物大分子单体结构的解析可以获得这些大分子的三维结构,了解其重要的功能区域,从而阐释生物大分子在生物体中发挥功能的结构基础;另一方面通过对相互作用的蛋白质以及蛋白质与核酸等复合物的结构解析,清楚地揭示生物大分子之间相互作用的方式和作用机理。此外,生物大分子的功能研究对结构分析起到重要的指导作用,如果没有深入透彻的功能研究,对大分子的结构与功能关系的分析也仅是理论上的推测,缺乏实际的实验支持。因此,结构解析和功能研究是相互依赖相辅相成的。为了更详尽理解结构与功能的关系,我们制备了DPY-30-like C端结构域和Musashi RRM1结构域的晶体并解析了它们的三维结构。人源DPY-30-like是线虫剂量补偿效应复合物的重要成员——DPY-30的同源蛋白。剂量补偿效应是生物体在进化过程为了应对由性染色体差异而可能造成的危害的一种机制,线虫雌性个体（XX型）通过降低X连锁基因的表达而使得X连锁基因的表达与雄性的表达水平相当。此外,DPY-30-like及其同源蛋白广泛存在于包括酵母、线虫、果蝇和人的组蛋白甲基转移酶复合物中,并与ASH2L及其同源蛋白相互作用。通过构建DPY-30-likeC端55个氨基酸的原核表达载体、表达、纯化及一系列结晶条件的摸索,最终得到了高分辨率的母体和硒代蛋白晶体,采用单波长反常散射法（SAD）解析了DPY-30-like C端结构。对DPY-30-like C端结构域解析发现其是两个单体紧密包裹的二聚体。分析超离和分子筛的结果同时证明DPY-30-like C端结构域在溶液状态下的分子量约为14.2kDa,与二聚体的分子量接近,说明其存在状态为二聚体形式。每个DPY-30-like C端结构域单体是由2条α螺旋和中间的一段柔性区组成的,两个单体反向排列形成类似X形状的二聚体。参与二聚体形成的主要作用力为疏水相互作用和位于蛋白两端的氢键作用力。二聚体表面形成一个明显的较宽区域的疏水面,这与PKA的调节亚基的N端RⅡα具有相似的蛋白表面的电荷性质,提示此类蛋白与其它蛋白相互作用区域具有相似的理化性质。疏水表面也可能是DPY-30-like结合ASH2L的区域。另一个解析的蛋白质为Musashi 1,它是一类在神经系统特异表达的RNA结合蛋白,广泛分布在神经干细胞、神经前体细胞和某些特定的肿瘤细胞中,通过结合numb的特征序列抑制它的翻译,激活Notch信号通路,促使细胞增殖。采用与DPY-30-like C端相似的表达纯化手段,通过筛查不同的晶体生长条件最终得到分辨率为1.8（?）的晶体,数据收集之后采用分子置换的方法解析了Musashil RRM1的结构。Musashil RRM1具有典型的RRM结构域的特点,形成β1α1β2β3α2β4的结构特征,其β1β3形成的疏水面含有保守残基Phe8、Phe48、Phe50,这三个氨基酸的突变会导致MusashilRRM1结合RNA的能力完全丧失。说明该疏水面对于保持RNA结合能力的重要性。通过对DPY-30-like C端结构域和Musashil RRM1的结构域的解析,我们对这两个结构域的三维结构有了清楚的认识,通过对结构域的解析,发现它们分别是DPY-30-like和Musashil的主要功能区域,并对其的作用机制进行了合理的推导,为之后的功能研究提供了一定的结构基础。