凯特与新世纪杏及其F1代杂种自交亲和与不亲和性差异的分子机理研究

论文摘要

本文为研究杏自交不亲和性强度差异的机理,以自交亲和（Self-compatibility:SC）品种凯特（Prunus armeniaca L.cv. Katy）与自交不亲和（Self-incompatibility:SI）品种新世纪（Prunus armeniaca L.cv. Xinshiji）及其杂交F1代部分杂种为试材,从生理及S-RNase基因DNA、RNA和蛋白水平比较了自交亲和与自交不亲和两种类型差异;对自交亲和和不亲和性杂种后代授粉后花柱蛋白质组进行了比较研究。主要研究结果如下:1.授粉后初期,凯特与新世纪的花粉都能正常萌发、生长,但是在花粉管生长延伸到花柱1/2以后,凯特的花粉管能顺利进入子房,而新世纪的花粉管多数停止向下生长,并发现有花粉管顶端膨大现象,只有极个别能正常生长到达子房;花粉管生长速度受外界环境温度影响较大,在活体中花粉从柱头萌发到花粉管进入子房,时间可以从24-72 h不等,生长速度越快,不亲和花粉管在花柱中生长受抑制程度越弱。2.检测出三个新的S-RNase基因片段,命名为P.a S8（来自凯特）、P.a S9与P.a S10（来自新世纪）,已经在GenBank中注册（注册号分别为:AY864826、AY864825、AY884212、AY853594、AY846872）;进一步对3个S-RNase基因的DNA和其相应的cDNA序列进行比对,发现在第二、第三保守区之间的高变区中,存在有一段内含子,S8、S9、S10基因的内含子长度分别为406bp、471bp、104bp;结合GenBank中Blast的结果,对蔷薇科李属（Rosaceae Prunus）果树55个S-RNase基因构建系统进化树,显示李属果树S-RNase基因的种内相似性并不高于种间相似性。3.凯特和新世纪中S-基因的mRNA在气球期花柱中都表达;自交亲和与自交不亲和杏的S-RNase基因在授粉前后的发育进程中不仅表达模式不同,而且在决定亲和性的关键时期即授粉后24 h存在表达量的明显差异,新世纪中表达丰度比凯特明显要高;在带柱头的花柱上部、花柱下部及子房各部位中,S-RNase的表达分布不均匀,以花柱上部表达量最丰富;异花授粉后S-RNase基因表达维持在较高水平不继续下调,而自花授粉与不授粉的表达模式无明显差异,均显示持续下降趋势。4.检测没有发现凯特×新世纪F1代杂种的S-RNase基因出现任何形式的碱基突变与序列重组,鉴定出F1代23、37号的S基因型为S9Sc（Sc表示在花柱中缺失的自交亲和基因）,29、31号的S基因型为S8S9,杂种35、40号的S基因型为S8S10;按不同的S-基因型分别分析S-基因相对表达量与自交不亲和性的关系,可以看出,只表达一条S-基因的株系,无论S-基因相对表达量高还是低,都表现为自交亲和;表达两条S-基因的株系,

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 问题的提出
• 2 植物自交不亲和性研究进展
• 2.1 植物自交不亲和性分类
• 2.2 孢子体自交不亲和性研究进展
• 2.3 配子体自交不亲和性研究进展
• 2.3.1 罂粟属信号介导的自交不亲和性研究进展
• 2.3.2 S-RNase 系统 SI 的雌蕊 S-基因研究进展
• 2.3.3 S-RNase 系统 SI 的花粉 S-基因研究进展
• 2.4 与自交不亲和相关的非 S-因子研究进展
• 2.5 自交不亲和性的起源与进化
• 2.6 蔷薇科果树及杏自交不亲和性研究进展
• 3 本研究的内容及目标
• 第一章 杏自交不亲和性相关生理特性研究
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 自交亲和性的田间鉴定
• 1.1.3 花粉采集及发芽力的测定
• 1.1.4 荧光显微镜观察花粉管生长
• 1.1.5 可溶性蛋白含量的测定
• 1.1.6 制作 BSA 蛋白含量标准曲线图和测定花柱可溶蛋白含量
• 1.1.7 花柱 RNA 酶酶活力检测
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 自花授粉坐果率调查
• 1.2.2 花粉发芽率
• 1.2.3 荧光显微镜观察花粉萌发和花粉管生长状况
• 1.2.4 气球期花柱蛋白含量
• 1.2.5 气球期花柱蛋白 RNA 酶比活力
• 1.3 讨论
• 1.3.1 RNA 酶比活力与花粉管生长的关系
• 1.3.2 花柱中 RNase 活性与自交不亲和性
• 1.4 结论
• 第二章 自交不亲和性相关S-RNase 基因的检测及表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 基因组DNA 提取
• 2.1.3 花柱RNA 的提取
• 2.1.4 S-等位基因专一性PCR 扩增
• 2.1.5 S-RNase 基因特异片段的克隆及序列分析
• 2.1.5.1 连接反应
• 2.1.5.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.5.3 大肠杆菌感受态细胞的转化及阳性克隆的筛选测序
• 2.1.5.4 序列分析
• 2.1.6 实时荧光定量RT-PCR
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 凯特与新世纪S-RNase 基因的检测
• 2.2.2 凯特与新世纪S-RNase 基因的RT-PCR 检测
• 2.2.3 凯特、新世纪S-RNase 基因的核苷酸序列
• 2.2.4 检测的新 S-RNase 基因推导的氨基酸序列及与已知的蔷薇科李属 S-RNase 基因的进化关系
• 2.2.5 杏 S-RNase 基因在不同发育阶段转录水平表达特性
• 2.2.6 S-RNase 基因在花柱各部位转录表达特性
• 2.2.7 授粉对S-RNase 基因转录表达的影响
• 2.3 讨论
• 2.3.1 关于杏S-RNase 基因的特异引物
• 2.3.2 关于凯特 S-RNase 杏一条带的问题
• 2.3.3 凯特、新世纪 S-RNase 基因的序列特征
• 2.3.4 关于蔷薇科果树 S-RNase 基因的系统进化
• 2.3.5 实时荧光定量PCR技术与S-RNase基因的表达
• 2.3.6 关于自交亲和与不亲和杏 S-RNase 基因的表达模式
• 2.3.7 授粉对自交不亲和性 S-RNase 基因转录水平表达模式的影响
• 2.4 结论
• 第三章 杏杂种 F1代自交不亲和性差异的分子机理研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 基因组 DNA 提取
• 3.1.3 花柱RNA 的提取
• 3.1.4 S-等位基因专一性 PCR 扩增
• 3.1.5 S-RNase 基因特异片段的克隆及序列分析
• 3.1.6 实时荧光定量 RT-PCR
• 3.1.7 花柱蛋白的提取
• 3.1.8 双向电泳及图像分析
• 3.1.9 差异蛋白质点的酶解
• 3.1.10 差异蛋白质点的鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 杏杂种F1 代S 基因型的鉴定
• 3.2.2 凯特、新世纪及6 株F1 代S 基因m RNA 表达量的实时检测
• 3.2.3 完全自交不亲和杏29 号自花与异花授粉后花柱蛋白质组比较
• 3.2.4 完全自交不亲和杏29 号与自交亲和杏23 号自花授粉后花柱蛋白质组比较
• 3.2.5 杏杂种29 号、23 号亲和与不亲和授粉后 S-RNase 表达量比较
• 3.2.6 杏亲和与不亲和授粉后雌蕊差异蛋白质分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 S-基因转录表达量与自交不亲和性的相关性
• 3.3.2 蛋白质组水平研究自交不亲和性的意义
• 3.3.3 LC-ESI-MS/MS 检测差异蛋白的局限性
• 3.3.4 鉴定的点表观分子量、等电点与理论计算值的偏差
• 3.3.5 可能与自交不亲和性相关的差异蛋白.
• 3.3.6 其它差异蛋白在自交不亲和反应中可能的功能
• 3.4 结论
• 小结
• 1 本论文的主要结论
• 2 本论文的主要创新点
• 3 下一步的工作设想
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士期间发表的论文