基于芯片的嗜酸氧化亚铁硫杆菌的比较基因组学

论文摘要

嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)是一种重要的应用与微生物浸出金属的细菌。为了能够更加深入的研究A.ferrooxidans,以TIGR公布的A.ferrooxidans ATCC 23270的全基因组序列为基础构建了该种细菌的全基因组芯片。该芯片包含3100个ORF序列,探针长度为50个核苷酸,序列相似性低于85%,且每个探针都不含冗余序列。对构建的芯片分别进行温度、灵敏度、定量性、特异性评估。温度评估采用5个温度(45℃,50℃,60℃,65℃,70℃)进行杂交测试,结果显示50度时杂交效果最好。灵敏度与定量性的评估利用7个A.ferrooxidans的DNA浓度进行杂交测试,结果显示在灵敏度方面当DNA浓度到达50ng时芯片上的ORF点就基本上都有杂交信号(97.5%)。而在定量方面显示,DNA浓度和杂交信号之间有明显的线形关系(r~2=0.98)。挑选五个功能基因(硫醌还原酶,细胞色素C,亚铁氧化酶,抗汞蛋白,含铁固氮酶)设计引物并PCR扩增,当把该五个PCR产物与芯片杂交后显示芯片上对应该五个基因的点都有明显的杂交信号,而其他点的杂交信号则非常的弱。利用构建的芯片对12株筛选自中国矿山(酸性矿坑水)的A.ferrooxidans进行全基因组多样性分析。3100个ORF中,1235个ORF是至少在一株检测的菌株中缺失,这些基因代表不同株A.ferrooxidans间的差异。另外1385个ORF是存在于所有的菌株中,这些保守基因是该种细菌适应环境条件的基础。针对基因的多样性,重点讨论了电子传递、胞外多聚体、解毒、离子转运、调控等功能基因。分别利用了全基因组的杂交信号和生物浸矿相关功能(电子传递,硫代谢,离子转运)基因的杂交信号进行聚类分析。通过建立的两个系统发育树和主成分分析表明,对整个基因组而言,影响该种细菌进化的主要影响因素是空间距离。而只对浸矿基因,空间距离的影响因素明显减少,而地理化学性状的影响则显得更加重要,尤其是pH,Ca,Mg,Cu,S,Fe,Al七个影响因素。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 嗜酸氧化亚铁硫杆菌研究进展
• 1.1.1 嗜酸氧化亚铁硫杆菌对硫化矿浸出机理
• 1.1.2 嗜酸氧化亚铁硫杆菌呼吸链模型
• 1.1.3 嗜酸氧化亚铁硫杆菌碳代谢模型
• 1.1.4 嗜酸氧化亚铁硫杆菌的重金属抗性
• 1.2 基因芯片概述
• 1.2.1 基因芯片的产生和发展
• 1.2.2 基因芯片的应用
• 1.3 基于芯片的比较基因组学研究进展
• 1.3.1 比较基因组学对微生物进化的研究
• 1.3.2 比较基因组学对微生物基因组多样性与可塑性的研究
• 1.5 课题的研究目的与研究内容
• 1.5.1 依据和目的
• 1.5.2 论文课题受资助情况
• 1.5.3 论文的主要研究内容
• 第二章 芯片的构建与评估
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 细菌的培养与基因组的提取
• 2.1.2 PCR引物设计与扩增
• 2.1.3 探针的设计
• 2.1.4 芯片的制作
• 2.1.5 DNA定浓
• 2.1.6 DNA的荧光标记与杂交
• 2.1.7 芯片扫描
• 2.2 结果
• 2.2.1 探针设计
• 2.2.2 杂交温度评估
• 2.2.3 灵敏度与定量性评估
• 2.2.4 芯片特异性评估
• 2.3 讨论
• 第三章 嗜酸氧化亚铁硫杆菌比较基因组学研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株与培养
• 3.1.2 酸性矿坑水全元素分析
• 3.1.3 摇瓶浸矿实验
• 3.1.4 细菌基因组提取、荧光标记、杂交
• 3.1.5 杂交信号数据分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 酸性矿坑水元素组成与含量
• 3.2.2 浸矿活性
• 3.2.3 12株Acidithiobacillus ferrooxidans的全基因组杂交结果
• 3.2.4 各类功能基因杂交结果
• 3.2.5 杂交结果的聚类分析
• 3.2.6 杂交结果的主成分分析
• 3.3 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 研究成果