猪水肿毒素A亚基单抗的制备及竞争ELISA检测方法的建立

论文摘要

猪水肿病（Porcine Edema disease,ED）是常见的一种仔猪急性、致死性传染病,是由某些特定血清型的大肠杆菌引起的肠毒血症。该病的直接致病因子是产志贺样毒素大肠杆菌（Shiga-like toxigenic E.coli,SLTEC）产生的一种志贺样毒素Ⅱ型变异体（Shiga-like toxinⅡe,SLT-Ⅱe）,又称猪水肿毒素。SLT-Ⅱe的分子结构由一个A亚单位和5个B亚单位组成。SLT-Ⅱe通过其B亚单位与猪肠上皮细胞的特异性受体发生结合,介导A亚单位进入细胞核糖体,其A1亚基与核糖体大亚基28SrRNA发生接触反应阻止氨酰tRNA与核糖体RNA结合,从而阻断细胞内蛋白质的合成,导致细胞死亡。因此,SLT-Ⅱe是该菌致病性的重要物质基础,是制备毒素的特异性抗体理想的靶抗原。鉴于猪水肿病是一种造成断奶仔猪死亡并在世界范围内广泛存在的重要疾病。对猪群的血清学检测以及疫苗免疫是预防和控制该病的关键,然而目前为止,市面上还没有商品化的疫苗及血清学检测方法。本实验室研究生已经分别克隆表达了猪水肿毒素A亚基和B亚基,利用纯化的蛋白建立了间接ELISA方法,但是该方法采用大肠杆菌的融合表达蛋白含有大肠杆菌蛋白,在临床应用上常会产生假阳性的结果,因此需要进行改进。本研究就是利用猪水肿病大肠杆菌SLT-ⅡeA表达蛋白制备其单克隆抗体,旨在建立检测猪水肿毒素抗体的单抗竞争ELISA方法,具体研究情况如下:1.猪水肿毒素A亚基单克隆抗体的制备及鉴定以纯化的猪水肿毒素A亚基基因片段的原核表达蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选,采用有限稀释法对其进行克隆,最终获得10株能稳定分泌抗猪水肿毒素A亚基蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E12、2G11、5812、2E3、4F4、4G2、1A10、4A7、4812、3H7。细胞培养上清ELISA效价为22×100～25×100,腹水ELISA效价可达28×100～214×100。与蛋白亲和力试验表明,这10株单抗具有较高的亲和力。Western-blot结果表明,10株单抗都可以与表达蛋白反应,其中有8株单抗可以与天然水肿毒素反应。Vero细胞中和试验表明,只有3H7和4G2具有一定的中和活性。2.竞争ELISA方法的建立和初步应用本研究以辛酸—硫酸铵法纯化3H7单抗腹水,以改良过碘酸钠法标记纯化的3H7单抗,制备酶标单克隆抗体。以原核表达蛋白SLT-ⅡeA为抗原,以酶标单抗为检测抗体,建立检测猪水肿毒素抗体的单抗竞争ELISA方法。用方阵滴定确定蛋白包被浓度为0.32μg/mL,酶标单抗的工作浓度为1:3200,血清稀释度为1:2,通过检测30份阴性血清,120份阳性血清,确定血清抑制率大于40%判定为阳性。特异性、重复性及临床试验结果表明,该方法特异性强、重复性好、稳定性高。本实验通过单克隆抗体制备的常规技术,获得针对猪水肿毒素A亚基的抗体,用纯化的单抗和HRP进行标记,获得可以与阳性血清竞争的酶标抗体。同时,对影响ELISA试验的主要因素进行了摸索,对研制的诊断试剂盒的特异性、敏感性、重复性等进行研究和探索,为下一步试剂盒的应用打下了基础。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩略词（Abbreviation）
• 1 文献综述
• 1.1 猪水肿病的病原学
• 1.1.1 猪水肿病的发现
• 1.1.2 产类志贺毒素大肠杆菌的特征
• 1.2 猪水肿病大肠杆菌的毒力因子
• 1.2.1 类志贺毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）
• 1.2.2 F18ab菌毛
• 1.3 猪水肿病流行病学
• 1.4 猪水肿病发病机理及影响因素
• 1.4.1 免疫能力
• 1.4.2 营养水平
• 1.4.3 遗传抗性
• 1.5 猪水肿病的诊断
• 1.5.1 临床症状及剖检病变
• 1.5.2 实验室诊断方法
• 1.6 猪水肿病的免疫研究
• 1.6.1 药物预防
• 1.6.2 菌体灭活苗
• 1.6.3 亚单位苗
• 2 目的和意义
• 3 材料和方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 生物材料
• 3.1.2 血清
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要试剂配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 GST-SLT-ⅡeA蛋白的表达、纯化和鉴定
• 3.2.2 SLT-ⅡeA间接ELISA检测方法的建立
• 3.2.3 单克隆抗体的制备
• 3.2.4 单克隆抗体的鉴定
• 3.2.5 单克隆抗体的生物学功能研究
• 3.2.6 单抗竞争ELISA方法的建立
• 3.2.7 单抗竞争ELISA方法的临床应用
• 4 结果
• 4.1 原核表达蛋白的提取和纯化
• 4.2 SLT-ⅡeA间接ELISA方法的建立
• 4.3 单克隆抗体的制备和鉴定
• 4.3.1 融合后筛选及克隆化培养结果
• 4.3.2 细胞融合后结果观察
• 4.3.3 染色体计数结果
• 4.3.4 单克隆抗体的亚类鉴定
• 4.3.5 单克隆抗体的ELISA效价和相对亲和力的测定
• 4.3.6 单克隆抗体的特异性试验结果
• 4.3.7 单克隆抗体识别抗原表位
• 4.3.8 单克隆抗体的稳定性检测
• 4.4 单克隆抗体的生物学功能研究
• 4.4.1 Vero细胞毒性中和试验
• 4.4.2 体内中和试验
• 4.5 单抗竞争ELISA方法的建立
• 4.5.1 单克隆抗体的纯化
• 4.5.2 酶标单抗的制备
• 4.5.3 竞争ELISA方法的优化
• 4.5.4 特异性试验
• 4.5.5 敏感性试验
• 4.5.6 重复性试验
• 4.5.7 与Vero细胞中和试验符合率
• 4.6 竞争ELISA检测方法的临床初步应用
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢