肠易激综合征神经调控异常分子机制的研究

论文摘要

肠易激综合征（irritable bowel syndrome, IBS）是一种常见的慢性功能性胃肠疾病,以腹痛或腹部不适为主要症状,排便后可改善,常伴有排便习惯改变（腹泻/便秘）,缺乏可解释症状的形态学和生化学异常。IBS患者的特征性临床表现是在直肠球囊扩张刺激时可表现出更高的内脏敏感性,因此内脏高敏感也被认为是IBS发病的重要病理生理机制之一。目前关于IBS内脏敏感性增加的发病机制尚不完全清楚,认为可能的机制包括：（1）大脑中枢对肠道的传入信号感知增强；（2）脊髓中央管背侧的感觉神经纤维处于高敏状态；（3）分布于内脏的初级感觉神经纤维敏感性增强。近年来肠神经系统的调控异常在IBS发病机制中的作用引起了许多学者的关注。结肠的正常生理功能在很大程度上取决于肠神经系统的自主调控。其中,黏膜神经纤维在位于肠上皮固有层深部的隐窝附近形成一个细神经纤维束网,对肠道感觉信息的传递起重要的调节作用。那么IBS患者内脏感知异常是否与肠神经系统结构和功能的改变有关,其可能的分子机制是什么,到目前为止尚不清楚。在本论文中,我们对IBS患者结肠标本的神经纤维行光镜和电镜观察,确立IBS患者肠神经纤维存在形态可塑性的改变,并对其中潜在的分子机制进行了深入的探讨。脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor, BDNF）是本研究的关键因子,一方面BDNF广泛分布于神经系统,作为神经营养物质在神经元分化、发育和损伤修复中发挥重要作用,另一方面研究报道适量的内源性BDNF可维持感觉神经及其神经通路的正常功能,但其异常升高则可导致慢性疼痛、炎症性疼痛和内脏疼痛等多种与疼痛相关的异常感觉的产生。同时P物质和降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide, CGRP）等与痛觉相关的神经肽被证实在感觉神经元的分泌囊泡中与BDNF共储存。因此BDNF极有可能参与调节IBS患者肠神经系统形态和功能的可塑性,并与IBS患者的腹痛症状密切相关。我们对IBS患者的临床研究以及结合BDNF基因敲除小鼠的基础研究充分证实了以上观点。另外,目前越来越多的临床资料表明心理应激因素与IBS内脏高敏感的发生密切相关。在本研究中,我们模仿IBS患者的日常应激体验,对实验大鼠行避水应激干预,探讨IBS患者肠道感觉异常的可能神经调控分子机制。我们的研究集中于脊髓的背根神经节以及表达于背根神经节的瞬时感受器电位离子通道蛋白TRPV1和TRPA1。脊髓背根神经节含有传递结直肠感觉信息的传入神经元,接收腰内脏神经和盆神经传递的肠道感觉信号。研究报道TRPV1和TRPA1两种因子参与组织损伤或炎症状态下躯体和内脏高敏感的发生。在本研究中,我们揭示了避水应激通过何种神经通路影响肠道感觉信息的传递,并首次从正反两方面论证TRPV1和TRPA1参与应激引起的IBS内脏高敏感的发生,为IBS的治疗提供了新的作用靶点。第一部分肠神经调控异常在肠易激综合征患者腹痛发生中作用的研究中文摘要背景肠易激综合征（irritable bowel syndrome, IBS）是一种常见的慢性功能性胃肠疾病,以腹痛或腹部不适为主要症状,排便后可改善,常伴有排便习惯改变（腹泻/便秘）,缺乏可解释症状的形态学和生化学异常。在消化门诊,腹痛/腹部不适是IBS患者最常抱怨的症状,因而被认为是IBS的特征性临床表现。IBS内脏敏感性增加的发病机制尚不完全清楚,目前认为可能的机制包括：（1）大脑中枢对肠道的传入信号感知增强；（2）脊髓中央管背侧的感觉神经纤维处于高敏状态；（3）分布于内脏的初级感觉神经纤维敏感性增强。近年来,IBS患者内脏敏感性增强的分子机制引起了许多学者的关注。脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor, BDNF）作为神经营养物质的一员,广泛分布于神经系统,在神经元分化、发育、存活中发挥重要作用。适量的内源性BDNF可维持感觉神经及其神经通路的正常功能,但其异常升高则可导致慢性疼痛、炎症性疼痛和内脏疼痛等多种与疼痛相关的异常感觉的产生。慢性胰腺炎患者胰腺组织BDNF表达水平明显升高,并与患者疼痛症状相关。动物研究中,由完全性弗氏佐剂导致的炎症小鼠的BDNF mRNA的含量在脊髓背侧角明显升高,证实BDNF在炎症性疼痛中起了重要的调节作用。研究表明BDNF表达于多个物种的肠神经系统和肠道黏膜,在人类肠神经系统亦有表达,从而提示内源性BDNF可能会参与IBS患者内脏高敏感的发病过程。P物质（Substance P, SP）和降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide, CGRP）是感觉神经元的重要标志,且与疼痛的发生密切相关。SP可刺激内脏血管扩张并介导内脏疼痛。肠黏膜肥大细胞与SP阳性神经纤维的相互作用是IBS患者临床症状出现的重要触发因素。CGRP表达于整个消化道的内在和外在神经系统,并参与三硝基苯磺酸诱导的结肠炎大鼠内脏高敏感的发生。值得关注的是,SP和CGRP在中枢和外周神经系统的感觉神经元分泌囊泡中与BDNF共储存。SP和CGRP是否也参与IBS患者内脏高敏感的发生需进一步研究证实。人体肠神经系统由埋在肠壁内的神经细胞、神经胶质细胞组成。神经细胞通过轴突联系,形成含有/或不含有神经节的肠神经丛,从而调节肠道的生理功能。肠神经丛分布于肠肌层、黏膜下层和黏膜固有层。在结肠,黏膜神经纤维在位于上皮固有层深部的隐窝附近形成一个细神经纤维束网。结肠的正常生理功能在很大程度上取决于肠神经系统的自主调控。多项研究表明炎症性肠病患者肠神经系统的结构破坏可导致结肠感觉和运动功能异常,甚至在疾病缓解期亦如此。另外,在人的结肠可检测到高水平BDNF的表达,这提示BDNF可能在肠神经系统的形态可塑性方面发挥重要的调节作用。然而迄今为止,有关BDNF诱导IBS患者肠黏膜神经纤维可塑性改变的研究尚未见报道。目的1.探讨不同亚型IBS患者肠黏膜和血浆BDNF的表达水平改变；2.探讨IBS患者肠黏膜BDNF表达水平与腹痛症状的相关性,以及与疼痛相关的神经肽（P物质和CGRP）表达、肠黏膜神经纤维密度和神经纤维超微结构改变等因素在IBS腹痛发生机制中的作用。方法1.研究对象及标本采集本研究入选40例IBS患者和21例正常对照者。研究方案经山东大学齐鲁医院医学伦理委员会批准实施。所有受试对象在入组前均了解实验过程,并填写知情同意书。IBS的诊断采用罗马Ⅱ诊断标准,根据患者临床表现不同进一步分为腹泻型和便秘型两个亚型。正常对照选择来我院行结肠镜检查发现有结肠息肉者。结肠镜检查前留取受试者的血浆标本。结肠镜下在直肠乙状结肠交界处取肠黏膜活检标本6块,其中2块用于石蜡切片的HE染色和BDNF、PGP 9.5免疫组织化学染色；2块用于蛋白质提取并检测其中BDNF、P物质和CGRP的蛋白表达水平；2块用于透射电镜观察肠黏膜神经纤维超微结构改变。2.腹痛/腹部不适自评量表和医院焦虑抑郁自评量表IBS患者根据就诊前两周的腹部症状填写量表,评估指标包括患者的腹痛程度和腹痛频率。腹痛程度评分标准：0分为无腹痛症状；1分为腹痛轻微,不影响日常活动；2分为腹痛较轻,需要费劲才能忽视,日常活动尚不需要调整；3分为腹痛较重,日常活动受影响且需要调整；4分为腹痛严重,不能参加日常活动。腹痛频率评分标准：0分为无腹痛；1分为腹痛在1周内有1天会发作；2分为腹痛在1周内有2-3天会发作；3分为腹痛在1周内有4-6天会发作；4分为腹痛每天都有发作。每位受试者需同时根据就诊前两周内的精神心理状况完成医院焦虑抑郁自评量表。该量表采用4分制（0-3分）评价与焦虑抑郁相关的14个问题（题目2,4,6,8,11,12,14与焦虑症状相关,题目1,3,5,7,9,10,13与抑郁症状相关）。当患者焦虑和抑郁症状评分≥8分时,考虑存在精神心理异常的可能。3.HE染色和免疫组织化学染色结肠黏膜活检标本用10%中性福尔马林缓冲液固定并切成4μm厚的切片标本,行HE染色和免疫组织化学染色。PGP 9.5阳性染色选择×40放大倍数,用Image-pro plus5.0计算机图像分析系统测定每个视野阳性染色的面积,取PGP 9.5阳性染色面积/视野面积的比值来表示结肠黏膜神经纤维的密度。BDNF阳性染色选择×20放大倍数,测定每个视野阳性染色的累积光密度（integral optical density, IOD）,并计算阳性染色区域面积,取IOD/阳性染色面积比值作为BDNF表达水平的定量指标。每个视野均有两位独立的观察者进行测定统计,取两者的平均值进行最终的统计分析。4.电镜检测结肠活检标本立即置入2.5%戊二醛溶液中固定,继以2%四氧化锇固定,丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋,制成超薄组织切片。甲苯胺蓝染色后,光镜下观察肠黏膜神经纤维的分布。电镜超薄切片继以醋酸双氧铀溶液和柠檬酸铅溶液双染,在日本日立公司H-600电镜下观察肠黏膜神经纤维的超微结构改变。5.酶联免疫吸附试验肠黏膜标本制成匀浆后,15000转/分钟4℃离心15分钟,取上清并储存于-80℃冰箱中备用。BCA试剂盒检测每份样本肠黏膜总蛋白含量后,根据购买的ELISA试剂盒说明书提供的操作步骤检测每份样本中BDNF, P物质和CGRP的含量。每份样本均设复孔。静脉血采用EDTA抗凝管采集,4000转/分钟4℃离心15分钟,取上层血浆并储存于-80℃冰箱中备用。根据购买的ELISA试剂盒说明书提供的操作步骤检测每份样本中BDNF的含量。每份样本均设复孔。结果1.研究对象的基本情况IBS组与正常对照组在年龄、性别组成上无明显统计学差异。IBS患者40例,其中腹泻型IBS患者21例（占52.5%）,便秘型IBS患者19例（占47.5%）。两组患者之间平均病程相近,IBS患者的腹痛/腹部不适程度评分和腹痛/腹部不适频率评分均显著高于正常对照者。同时IBS患者的焦虑评分和抑郁评分均高于正常对照者,但均无明显统计学差异。两组受试者结肠黏膜标本经HE染色光镜下观察示组织结构正常。2.免疫组织化学染色结果肠黏膜PGP 9.5阳性染色神经纤维在肠黏膜上皮间质内和黏膜肌层内呈散点状分布。IBS患者肠黏膜神经纤维分布密度明显高于正常对照者（肠上皮间质,P<0.001；黏膜肌层,P<0.01）。但在IBS亚型间神经纤维分布密度无明显统计学差异（肠上皮间质,P=0.55；黏膜肌层,P=0.42）。BDNF染色阳性区域位于结肠黏膜上皮细胞。免疫组织化学染色定量分析提示IBS患者结肠黏膜BDNF的表达水平明显高于正常对照者（P=0.001）。进一步研究发现BDNF表达在IBS患者亚型之间无明显统计学差异（P=0.46）。3.肠黏膜神经纤维超微结构特点电镜下观察结肠黏膜固有层内神经纤维束的超微结构特点。在IBS患者,肠黏膜神经纤维超微结构出现破坏,表现为：无髓神经纤维轴索肿胀,形态不规则；轴索内微管、微丝排列紊乱；轴索内线粒体肿胀,线粒体嵴消失；少数线粒体出现空化；轴索内有时可见大小不等的空泡；包绕轴索的基膜模糊,呈絮状改变。在IBS患者,肠黏膜施万细胞超微结构也出现破坏,表现为：施万细胞核内异染色质减少,密度降低；施万细胞浆内线粒体和内质网肿胀,数目减少；施万细胞膜边界模糊,甚至出现断裂。4. BDNF, P物质和CGRP含量检测通过酶联免疫吸附试验,我们发现IBS患者血浆BDNF含量与正常对照者相比有下降趋势,但经统计学处理差异不显著（P=0.34）. IBS患者亚型之间血浆BDNF含量无明显差异（P=0.85）。IBS患者肠黏膜BDNF表达水平明显高于正常对照者（P=0.003）。在两个亚型的IBS患者之间,肠黏膜BDNF表达水平无明显统计学差异（P=0.051）。需要注意的是,IBS-C患者肠黏膜BDNF表达水平虽高于正常对照者,但差异无显著性（P=0.1）。与正常对照者相比,IBS患者肠黏膜P物质的表达水平亦明显升高（P=0.013）。但是IBS患者肠黏膜CGRP的表达水平与正常对照者相比,无显著升高（P=0.55）,同时在IBS患者亚型之间,肠黏膜P物质和CGRP表达无明显统计学差异（P物质,P=0.87；CGRP, P=0.31）。6.肠黏膜BDNF含量与受试者腹痛/腹部不适症状评分相关性分析肠黏膜BDNF表达水平与受试者腹痛/腹部不适症状评分行Spearman相关性分析,结果显示,IBS患者肠黏膜BDNF含量与患者腹痛/腹部不适程度评分和腹痛/腹部不适频率评分均有良好的相关性。具体相关系数及P值如下：IBS患者肠黏膜BDNF水平与腹痛/腹部不适程度评分相关系数为0.57（P<0.001）,与腹痛/腹部不适频率评分相关系数为0.46（P=0.003）；正常对照者肠黏膜BDNF水平与腹痛/腹部不适程度评分相关系数为0.01（P=0.98）,与腹痛/腹部不适频率评分相关系数为0.06（P=0.81）。将IBS患者与正常对照者合并一起,肠黏膜BDNF水平与腹痛/腹部不适症状评分仍有良好的相关性（腹痛程度r=0.53,P<0.001；腹痛频率r=0.54,P<0.001）。结论1.IBS患者腹痛/腹部不适症状的发生与肠黏膜神经纤维结构破坏及肠黏膜BDNF表达增加有关。2.IBS患者肠黏膜神经纤维存在超微结构破坏可引起肠黏膜BDNF含量升高,BDNF表达升高同时导致IBS患者肠黏膜神经纤维密度增加。3. BDNF还可能通过促进IBS患者肠黏膜P物质的释放间接发挥致痛作用。第二部分肠神经调控异常在BDNF基因敲除小鼠内脏高敏感中作用的研究中文摘要背景脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养物质家族中的一员,在中枢和外周神经系统均有表达,且能促进中枢和外周神经元存活、生长和分化的活性蛋白因子。多篇研究报道BDNF在中枢的感觉调节功能,证实BDNF有致痛及致内脏敏感的作用。Tanure MT等研究发现偏头痛患者发作期的血清BDNF表达水平明显高于缓解期,提不BDNF可能参与了中枢神经性疼痛的病理生理过程。另有研究发现BDNF在调节大脑长时电位增强（LTP）中发挥重要作用。而LTP被认为是学习和记忆形成的重要机制,并且LTP参与外周神经神经源性疼痛的处理过程。Vanja Duric等研究发现由完全性弗氏佐剂后肢注射导致的炎症小鼠脊髓背侧角BDNF mRNA含量明显升高,证实BDNF在炎症性疼痛中起了重要的调节作用。在膀胱炎症大鼠模型中,BDNF表达明显上调,并且注射BDNF抗体后,可有效缓解大鼠对机械刺激的痛觉。在结肠,BDNF对肠神经系统的功能也发挥重要的调节作用。研究发现小鼠整个肠道内环肌和肠上皮组织BDNF mRNA表达均阳性。Delafoy等应用BDNF抗体腹腔注射可明显缓解TNBS模型大鼠的内脏敏感性,提示BDNF参与大鼠肠炎后结肠高敏感的发生。在另一TNBS致大鼠结肠炎模型中,炎症导致在腰骶部背根神经节中BDNF的蛋白与mRNA水平明显增高,而在腰骶部脊髓只有BDNF蛋白水平的增高,说明BDNF不在脊髓合成,是由背根神经节运送到脊髓发挥作用的。在第一部分的研究中,我们发现结肠黏膜BDNF表达增加可引起IBS患者肠黏膜神经纤维密度增加,且与IBS患者腹痛症状程度呈正相关,如果下调结肠黏膜BDNF的表达是否可降低肠道的敏感性?为验证这一设想,我们在国内外首次结合BDNF基因敲除小鼠,从反面论证BDNF因子对小鼠结肠敏感性的影响及机制。目的1.探讨BDNF+ -小鼠和BDNF+/+小鼠结肠黏膜BDNF的表达和小鼠肠神经纤维密度的差异,及与小鼠结肠敏感性的关系。2.探讨不同剂量外源性BDNF腹腔注射对正常野生型小鼠结肠敏感性的影响。方法1.实验动物清洁级健康雄性C57B1/6系6-8周龄BDNF-小鼠和以及同周龄正常野生型BDNF+/+小鼠,均由山东大学医学院神经生物学研究所提供。小鼠基因型通过PCR方法鉴定小鼠尾部组织中的DNA确定。小鼠饲养在温度20±1℃,相对湿度50%±5%,人工光照明暗各12h的普通级动物房中,并自由进食进水。待小鼠喂养至4月龄时进行试验。本研究遵循中国动物保护协会的规章制度,操作过程中尽可能减少小鼠的疼痛。2.实验方法该研究分为两个阶段。在第一阶段,选择BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠,检测两组小鼠24小鼠粪便含水量并计数小鼠1小时排便粪粒数。采用直肠球囊扩张检测两组小鼠的AWR评分,评估小鼠内脏敏感性的差异,验证BDNF在内脏敏感性中的作用。在第二阶段,选择正常野生型BDNF+/+小鼠,给予腹腔注射不同剂量的BDNF （0.1,1,10ng/小鼠）或0.1% BSA溶液做阴性对照,30分钟内行直肠球囊扩张,检测各组小鼠直肠球囊扩张压力阈值的差异。3.结直肠扩张和AWR评分小鼠禁食12小时,采用吸入氟烷麻醉后,将一段带有球囊的导管插入小鼠肛门,球囊距离小鼠肛门1cm处。用胶带将导管和小鼠尾巴绑牢,用以固定导管的位置。当小鼠苏醒后,在30分钟内检测小鼠的内脏敏感性。快速向球囊内充气,使球囊扩张压力短时间内分别达到0,15,30,45和60 mmHg,在两个压力梯度之间需将球囊气体排空,间隔4分钟。每个压力梯度持续20秒,重复3次,观察小鼠腹壁对直肠球囊扩张刺激的反应。腹部回撤反射评分标准如下：0分,直肠球囊扩张时无明显反应；1分：短暂的头部运动后停止；2分：腹部肌肉收缩；3分：腹部收缩并提起；4分,弓背并抬起骨盆。测量小鼠直肠球囊扩张刺激的感觉阈值时,缓慢向球囊内注气,使球囊内气体压力逐步升高,记录小鼠出现腹壁肌肉收缩反应（或者腹壁肌肉收缩节律破坏）时的压力阈值。评估指标包括结直肠扩张压力阈值（threshold intensity of CRD）和AWR评分两种。小鼠内脏敏感性检测由两位独立的操作者完成,测量数据均重复3次取平均值。4.免疫荧光取自BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠的结肠标本行免疫荧光染色。荧光显微镜下观察PGP 9.5阳性染色,用Image-pro plus5.0计算机图像分析系统测定每个视野阳性染色的面积,取PGP 9.5阳性染色面积/视野面积的比值来表示结肠黏膜神经纤维的密度。BDNF+/-组和BDNF+/+组每只小鼠的切片标本各取5个视野做统计分析。5.免疫组化BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠的结肠标本用10%中性福尔马林缓冲液固定并切成4μm厚的切片标本,行免疫组织化学染色。BDNF阳性染色选择×20放大倍数,用Image-pro plus5.0计算机图像分析系统测定每个视野阳性染色的累积光密度（integral optical density,IOD）,并计算阳性染色区域面积,取IOD/阳性染色面积比值作为BDNF表达水平的定量指标。每个视野均有两位独立的观察者进行测定统计,取两者的平均值进行最终的统计分析。6.酶联免疫吸附试验BDNF+/小鼠和BDNF+/+小鼠的结肠黏膜标本制成匀浆后,15000转/分钟4℃离心15分钟,取上清并储存于-80℃冰箱中备用。BCA试剂盒检测每份样本肠黏膜总蛋白含量后,根据购买的ELISA试剂盒说明书提供的操作步骤检测每份样本中BDNF的含量。每份样本均设复孔。结果1.小鼠粪便含水量和1小时排便粪粒数比较收集两组小鼠24小时粪便,烘干后计算各组小鼠粪便含水量,BDNF+/小鼠粪便含水量显著低于BDNF+/+小鼠（39.7±4.9% vs.50.7±3.8%,P<0.05）。同时,我们计数两组小鼠1小时的排便粪粒数,结果提示BDNF+/小鼠每小时排便粪粒数明显减少（5.3±2.4粒/小时vs.7.8±2.2粒/小时,P<0.05）。2.小鼠行为学检测我们采用直肠球囊扩张刺激检测BDNF+/+小鼠和BDNF+/小鼠的AWR评分,用以反映两种基因型小鼠内脏敏感性的差异。在直肠扩张压力≤30 mm Hg时,两组小鼠的AWR评分无明显差别。当直肠扩张压力升至45和60 mm Hg时,BDNF+/-小鼠的AWR评分明显低于BDNF+/+小鼠,从反面证实BDNF参与小鼠内脏感觉信息的产生（*P=0.03,**P<0.001）。除此之外,我们在正常野生型小鼠腹腔注射不同剂量的外源性BDNF因子,观察小鼠对直肠球囊扩张刺激的感觉闽值压力的变化。结果提示小鼠的感觉阈值压力随着腹腔注射BDNF剂量的增加呈阶梯型下降。在注射剂量为0.1ng/小鼠时,感觉阈值压力的变化尚无明显统计学差异（19.8±2.4 mm Hg vs.21.8±2.2 mm Hg, P=0.23）。当注射剂量为1ng/小鼠时,感觉阈值压力为15.4±3.4 mm Hg,当注射剂量为10ng/小鼠时,感觉阈值压力为12.6±1.9 mm Hg,均明显低于对照组小鼠（**P<0.01,***P<0.001）。3.免疫荧光荧光显微镜下观察小鼠结肠黏膜PGP 9.5显色情况,用以比较BDNF+/+小鼠和BDNF+/小鼠肠黏膜神经纤维密度的差异。结果提示BDNF+/小鼠结肠黏膜神经纤维密度明显低于BDNF+/+小鼠。4.肠黏膜BDNF免疫组化小鼠结肠标本免疫组化显示BDNF表达于肠黏膜上皮细胞,且定量分析显示BDNF+/小鼠肠黏膜BDNF表达水平明显低于BDNF+/+小鼠。5.肠黏膜BDNF含量检测BDNF+/小鼠肠黏膜BDNF的蛋白表达水平明显降低,大约为BDNF+/+小鼠肠黏膜BDNF水平的一半。结论1.与BDNF+/+小鼠比较,BDNF+/小鼠结肠粘膜神经纤维密度减少,结肠黏膜上皮细胞BDNF表达水平降低,且结肠敏感性下降。2.腹腔注射外源性BDNF可明显增加BDNF+/+小鼠的结肠敏感性。第三部分背根神经节TRPV1和TRPA1参与肠易激综合征内脏高敏感作用机制的研究中文摘要背景肠易激综合征（irritable bowel syndrome, IBS）是一种常见的慢性功能性胃肠疾病,以腹痛或腹部不适为主要症状,排便后可改善,常伴有排便习惯改变（腹泻／便秘）,缺乏可解释症状的形态学和生化学异常。IBS患者的特征性临床表现是在直肠球囊扩张刺激时可表现出更高的内脏敏感性,因此内脏高敏感也被认为是IBS发病的重要病理生理机制之一。目前越来越多的临床资料表明精神心理因素与IBS症状的发生、持续和加重等过程密切相关。例如年幼创伤性体验、社会应激、躯体虐待和不良的心理应对等因素都可增加IBS的发生机率,并且IBS患者比正常人更多抱怨日常生活中的应激事件。但是到目前为止,应激影响IBS患者内脏敏感性的分子机制尚不清楚。在本研究中,我们模仿IBS患者的日常应激体验,对实验大鼠行避水应激干预,探讨肠道感觉异常的可能机制。瞬时感受器电位离子通道蛋白（Transient Receptor Potential ion channel protein, TRPs）是一类存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的非选择性阳离子通道蛋白,目前认为TRPs参与温度、化学物质和机械刺激所诱导的痛觉的产生。TRPV1是研究最多、机制较为清楚的TRP家族成员之一。TRPV1表达于初级感觉神经元,可被机械刺激、伤害性热刺激（>43℃）、酸（pH<5.9）和辣椒素激活。有研究表明,TRPV1参与了乳鼠结肠扩张刺激和实验性肠炎引起的内脏高敏感的发生。TRPA1表达于感觉神经末梢,具有感受伤害性刺激的作用,如冷温度、芥末油、机械刺激等。在组织损伤和炎症状态下,TRPA1通道可被活化,并诱发躯体烧灼或刺痛的感觉。最新研究证实,TRPA1和TRPV1在初级感觉神经元共表达,因此TRPA1在介导肠道感觉的可能作用引起许多研究者的关注。利用TRPA1基因敲除小鼠,有学者发现TRPA1缺失可导致小鼠对结肠扩张刺激的敏感性下降。然而,TRPV1和TRPA1是否均参与心理应激引起的内脏高敏感的发生,到目前为止尚未见文献报道。在机体内,结直肠的感觉信息通过肠道感觉传入神经纤维到达中枢神经系统。这些传入神经纤维的胞体位于脊髓的背根神经节段,根据解剖部位的不同可分为两大类。胸腰段脊神经元（Thoracolumbar neurons, TL）位于脊髓的T10-L2背根神经节节段,通过腰内脏神经支配肠道；腰骶段脊神经元（Lumbosacral neurons, LS）位于脊髓的L6-S1背根神经节节段,通过盆神经支配肠道。目的1.对大鼠进行避水应激,观察其内脏敏感性的改变。2.检测支配避水应激大鼠肠道的腰内脏神经和盆神经相应脊髓背根神经节中TRPV1和TRPA1的表达改变。3.分别鞘内注射两种通道蛋白的拮抗剂,以探明TRPV1和TRPA1参与避水应激大鼠内脏高敏感的发生。方法1.动物选用6-8周雄性Wistar大鼠,体重250g-300g。大鼠饲养在温度20±1℃,相对湿度50%±5%,人工光照明暗各12h的普通级动物房中,并自由进食进水。为避免生物节律对动物生理机能的可能影响,所有的实验操作均在上午9：30至12：00之间进行。本研究遵循中国动物保护协会的规章制度,操作过程中尽可能减少大鼠的疼痛。2.避水应激实验在特制的玻璃水槽的中间固定一平台,平台大小为10×8×8cm,然后向玻璃水槽中注入温水（25℃）,水面的高度低于平台顶面1cm,将模型组大鼠逐只置于水中平台上,每次持续1小时,连续10天。对照组大鼠则置于未注水的平台上。10天后检测两组大鼠的内脏敏感性变化。3.结直肠扩张和AWR评分大鼠禁食12小时,采用吸入氟烷麻醉后,将一段带有球囊的导管插入大鼠肛门,球囊距离大鼠肛门4.5cm处。用胶带将导管和大鼠尾巴绑牢,用以固定导管的位置。将大鼠放入20×8×8cm大小的有机玻璃制成的固定架中。当大鼠苏醒后,在30分钟内检测大鼠的内脏敏感性。快速向球囊内充气,使球囊扩张压力短时间内分别达到0,10,20,40,60和80mmHg,在两个压力梯度之间需将球囊气体排空,间隔4分钟。每个压力梯度持续20秒,重复3次,观察大鼠腹壁对直肠球囊扩张刺激的反应。腹部回撤反射评分标准如下：0分,直肠球囊扩张时无明显反应；1分：短暂的头部运动后停止；2分：腹部肌肉收缩；3分：腹部收缩并提起；4分,弓背并抬起骨盆。测量大鼠直肠球囊扩张刺激的感觉阈值时,缓慢向球囊内注气,使球囊内气体压力逐步升高,记录大鼠出现腹壁肌肉收缩反应（或者腹壁肌肉收缩节律破坏）时的压力阈值。大鼠内脏敏感性检测由两位独立的操作者完成,测量数据均重复3次取平均值。4.蛋白电泳分离大鼠脊髓双侧T10-L1、L6-S1段背根神经节并提取蛋白质,进行总蛋白含量测定。每份蛋白样品按相同蛋白量依次上样,并以12%分离胶电泳分离,分离的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜放入5%脱脂奶粉封闭液中,室温下振荡封闭2h,随后将硝酸纤维素膜浸入TRPV1一抗或TRPA1一抗反应液中,4℃反应过夜。次日洗膜后,将硝酸纤维素膜浸入小型培养皿中的山羊抗兔或兔抗山羊二抗反应液中,室温振荡2h。条带光密度分析采用生物凝胶电泳图像分析系统Alpha EaseFC（?）扫描定量,以目的蛋白（TRP V1和TRPA1）密度值/内参蛋白密度值作为结果。5. TRPV1和TRPA1拮抗剂对避水应激大鼠内脏高敏感的影响我们应用TRPV1拮抗剂（capsazepine）和TRPA1拮抗剂（HC030031）来探讨TRPV1和TRPA1对避水应激大鼠内脏敏感性的影响。避水应激大鼠在直肠扩张刺激2h前分别鞘内注射capsazepine（1μg,10μg,100μg）或HC030031（1μg, 10μg, 100μg）,或者鞘内注射0.01mM PBS作为对照。记录大鼠直肠扩张压力阈值的变化。根据以上获得的关于内脏敏感性的初步结果,我们进一步选取鞘内注射100μgcapsazepine/HC030031来检测避水应激大鼠直肠球囊扩张AWR评分的变化。避水应激大鼠鞘内注射100μg capsazepine/HC030031,2小时后给予直肠球囊扩张,评估大鼠的AWR评分,并与鞘内注射PBS对照组大鼠做比较。该操作由两位不同的研究者独立完成。结果1.内脏敏感性检测1.1直肠扩张压力阈值避水应激组大鼠直肠扩张刺激的压力阈值明显低于正常对照组大鼠。1.2 AWR评分在直肠扩张压力<40mmHg时,避水应激组大鼠AWR评分虽高于正常对照组大鼠,但无统计学意义。当直肠扩张压力≥40mmHg时,避水应激组大鼠腹壁行为学反应明显增强,AWR评分显著高于正常对照大鼠。2.蛋白电泳2.1避水应激明显增加脊髓背根神经节TRPV1蛋白表达蛋白条带密度分析提示避水应激大鼠脊髓胸腰段和腰骶段DRG中TRPV1蛋白表达均明显高于正常对照大鼠。2.2避水应激明显增加脊髓背根神经节TRPA1蛋白表达与TRPV1蛋白表达变化趋势一致,蛋白条带密度分析提示避水应激同样引起大鼠脊髓TL（T10-L1）和LS（L6-S1）节段DRG中TRPA1蛋白表达明显增加。3. TRPV1和TRPA1拮抗剂对避水应激大鼠内脏高敏感的影响3.1 capsazepine对避水应激大鼠内脏高敏感的影响鞘内注射Capsazepine （1-100μg）后,避水应激大鼠直肠球囊扩张感觉阈值随着注射的拮抗剂剂量的增加而逐步升高。鞘内注射1μg Capsazepine时,避水应激大鼠内脏感觉阈值有增高趋势,但同PBS对照组大鼠相比,无明显统计学差异（P=0.16）。鞘内注射10μg和100μg Capsazepine时,大鼠内脏感觉阈值分别为24.80mmHg （20.98～27.78mmHg）和31.05mmHg （27.65-34.20mmHg）,同PBS对照组大鼠相比,内脏感觉阈值明显升高（*P=0.001,**P<0.001）。与PBS溶液鞘内注射的避水应激大鼠相比,Capsazepine 100μg鞘内注射可明显降低避水应激大鼠的内脏敏感性,表现为直肠球囊扩张压力≥40mmHg时,Capsazepine组大鼠的AWR评分均明显低于PBS对照组大鼠（*P=0.04 at 40mmHg,**P=0.001 at 60mmHg,***P<0.001 at 80mmHg）。3.2 HC030031对避水应激大鼠内脏高敏感的影响鞘内注射HC030031 （1-100μg）后,避水应激大鼠直肠球囊扩张感觉阈值随着注射的拮抗剂剂量的增加而呈现升高趋势。鞘内注射1μg和10μg HC030031时,大鼠内脏感觉阈值有一定幅度的增加,但均无显著统计学差异（P=0.23和P=0.06）。鞘内注射100μg HC030031时,大鼠内脏感觉阈值为28.80mmHg （26.47～33.15mmHg）,内脏感觉阈值明显高于PBS对照组大鼠（’P<0.001）。与PBS溶液鞘内注射的避水应激大鼠相比,HC030031 100μg鞘内注射可明显降低避水应激大鼠的内脏敏感性,表现为直肠球囊扩张压力≥60 mmHg时,HC030031组大鼠的AWR评分均明显低于PBS对照组大鼠（*P=0.03 at 60mmHg,**P<0.01 at 80mmHg）。结论1.慢性避水应激可导致大鼠对直肠扩张刺激的内脏敏感性增高。2.背根神经节TRPV1和TRPA1通道蛋白均参与慢性避水应激大鼠内脏高敏感的发生。3.支配结肠的腰内脏神经和盆神经均参与避水应激大鼠远端结肠感觉信息的传导。

论文目录

• 符号说明
• 第一部分 肠神经调控异常在肠易激综合征患者腹痛发生中作用的研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 研究对象与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图表
• 参考文献
• 第二部分 肠神经调控异常在BDNF基因敲除小鼠内脏高敏感中作用的研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 实验材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 第三部分 背根神经节TRPV1和TRPA1参与肠易激综合征内脏高敏感作用机制的研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 实验材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 英文论文一
• 英文论文二