小叶锦鸡儿SSR引物开发及遗传多样性研究

论文摘要

小叶锦鸡儿（Caragana microphylla Lam.）为豆科锦鸡儿属多年生饲用灌木,多分布于中国东北及内蒙古、河北、山西,陕西,山东等地；蒙古、西伯利亚也有分布。因其耐干旱、低温、能抗风沙,再生力强,耐瘠薄等特性而成为我国东北、西北地区良好的饲用灌木和生态保护先锋植物,具有极大的开发利用潜力。本研究所用材料为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所种质资源研究室提供的10个内蒙古中东部野生小叶锦鸡儿居群。利用ISSR-PCR技术开发小叶锦鸡儿SSR多态性引物,并利用所筛选引物进行小叶锦鸡儿遗传多样性及遗传结构研究。主要结果如下：1.选用四种ISSR引物（S1：（AG）10、S2：（AC）10、S3：（GA）10、S4：（CA）10）分别开发小叶锦鸡儿SSR引物,分别得到引物30对、0对、9对、4对,其产率相应为13.16%；0.00%；11.11%；9.09%,总产率为11.17%。从所开发结果看,小叶锦鸡儿基因组中含有大量的（AG）n片段,而（AC）n片段则相对很少；本次开发引物效率较传统方法高,但成本较大,需经两次测序和三次引物合成。2.为建立适宜小叶锦鸡儿SSR-PCR的反应体系,利用正交试验设计L16（45）,对模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶的浓度进行五因素四水平优化筛选,确立了最佳反应体系和扩增程序。即在25μL反应体系中包括：40ng模板DNA,3 mmol/L Mg2+,300μmol/LdNTP,0.6μmol/L引物,1UTaq DNA聚合酶,1×Buffer。反应程序为：94℃10 min；94℃45 s,65℃1 min,72℃1 min,10个循环,每循环的复性温度递减1℃；94℃45 s,55℃1 min,72℃1 min,30个循环；72℃10 min,4℃保存。3.应用上述优化体系对自行开发的SSR引物进行PCR筛选,共得到有效扩增引物37对,占总开发引物的86.05%,其中多态性引物21对,占有效扩增引物的56.76%,占总开发引物的48.84%。其余引物有5对（11.63%）得到扩增,但没有一致性,也与目的片段相差很大,最后有1对（2.32%）没有扩增产物,其原因可能为设计引物时所选用的序列为基因突变的片段。4.从21对多态性引物中选了10对进行小叶锦鸡儿遗传多样性研究,共检测到等位基因175个,He值在0.602-0.859之间,具有高多态性；10个居群的Nei基因多样性指数（H）变幅为0.683-0.830,平均为0.771,表现出较高的遗传多样性；其遗传分化系数Fst为9.5%,说明小叶锦鸡儿的遗传多样性有90.5%存在于居群内,是遗传变异的主要来源,此外,居群间也存在着一定的基因流动,其Nm=2.391；聚类分析结果显示,除科尔沁居群和鄂旗居群外,其余居群都是地理位置相近的聚到一起。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 小叶锦鸡儿的研究进展
• 1.1 小叶锦鸡儿的植物学特征与生物学特性
• 1.2 社会经济价值功能作用
• 1.3 小叶锦鸡儿的宏观研究进展
• 1.4 小叶锦鸡儿遗传多样性研究进展
• 2 SSR引物开发研究进展
• 2.1 基因组文库法
• 2.2 微卫星富集法
• 2.3 数据库检索
• 3 遗传多样性研究进展
• 3.1 限制性片段长度多态性（RFLP标记）
• 3.2 随机扩增多态性DNA（RAPD标记）
• 3.3 扩增片段长度多态性（AFLP标记）
• 3.4 简单序列重复（SSR标记）
• 3.5 内部简单重复序列（ISSR标记）
• 3.6 单核苷酸多态性（SNP标记）
• 4 立题依据及研究目标
• 4.1 立题依据
• 4.2 研究目标
• 第二章 利用ISSR-PCR技术开发SSR引物
• 1 材料与方法
• 1.1 材料来源
• 1.2 研究方法
• 1.3 主要试剂与仪器
• 2 结果
• 2.1 基因组DNA提取结果
• 2.2 基因组酶切结果
• 2.3 ISSR-PCR结果
• 2.4 扩增产物的连接转化结果
• 2.5 菌液PCR检测结果及一侧引物设计
• 2.6 巢式PCR扩增结果及另一侧引物设计
• 2.7 利用测序结果开发SSR引物结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三章 小叶锦鸡儿SSR-PCR体系建立、优化及引物筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料来源
• 1.2 研究方法
• 1.3 主要试剂与仪器
• 2 结果
• 2.1 DNA提取结果
• 2.2 SSR-PCR正交设计结果
• 2.3 优化体系的最终确定
• 2.4 优化体系的验证结果
• 2.5 多态性引物筛选结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第四章 小叶锦鸡儿遗传多样性SSR分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料来源
• 1.2 方法
• 2 小叶锦鸡儿遗传多样性SSR分析结果
• 2.1 10个微卫星位点的多样性分析
• 2.2 10个居群的多样性分析
• 2.3 小叶锦鸡儿遗传多样性参数与生态因子的相关分析
• 2.4 10个居群主坐标与基因流分析
• 2.5 10个居群间的遗传距离与遗传一致度
• 2.6 小叶锦鸡儿遗传距离与地理距离的相关分析
• 2.7 居群间遗传关系聚类分析
• 3 讨论
• 3.1 小叶锦鸡儿基因组DNA提取
• 3.2 SSR-PCR
• 3.3 小叶锦鸡儿居群的遗传多样性
• 3.4 小叶锦鸡儿DNA分子水平上的遗传结构与基因流
• 4 结论
• 第五章 总结与展望
• 1 总结
• 1.1 小叶锦鸡儿SSR引物开发
• 1.2 SSR-PCR体系建立、优化及多态性引物筛选
• 1.3 小叶锦鸡儿遗传多样性SSR分析
• 1.4 实验过程中发现的问题
• 2 展望
• 参考文献
• 作者简历
• 硕士期间参加的科研项目
• 硕士期间发表论文
• 致谢