大豆独脚金内酯合成相关基因的克隆、功能与分子进化分析

论文摘要

独角金内酯是新近发现的一种植物激素,能够通过抑制侧芽萌发来控制植物的分枝,也是植物与枞枝真菌共生的信号物质；对拟南芥、水稻、豌豆等模式植物相关研究已发现多个调控分枝发育的独角金内酯代谢通路基因。分枝是大豆重要的株型性状,由于该性状易受环境条件影响,遗传力较低,对控制大豆分枝相关基因的研究较少。利用近期公布的大豆全基因组序列信息可研究大豆目标基因（家族）在代谢通路中的作用,揭示其分子进化特点,其与分子遗传学研究相结合则可更全面掌握目标基因的遗传规律。本文通过反向遗传学策略对大豆多分枝（MAX1）、类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD）等独脚金内酯合成关键基因进行基因多样性、功能及分子进化特点等研究,以期了解大豆独角金内酯合成遗传体系的特点,为进一步的优异基因发掘及分子育种提供参考。主要研究结果如下：（1）通过RT-PCR等方法从栽培大豆科丰1号中克隆了大豆独脚金内酯合成关键基因GmMAX1,该基因全长为2709bp,包含4个外显子和3个内含子,开放阅读框长度为1362 bp,编码454个氨基酸,为P450超基因家族成员,归类于CYP711A。荧光定量PCR显示GmMAX1基因不但在大豆根茎叶等营养器官内表达,在生殖器官、幼胚甚至是愈伤组织中也稳定表达,说明该基因不但与大豆株型相关,可能也与大豆生殖器官和幼胚组织的发育有关。将GmMAX1转入拟南芥中,与对照相比,转GmMAX1拟南芥抽薹数减少,生长周期变长,表明GmMAX1参与调控大豆分枝和生育期性状。从代表性大豆资源群体中选择19份栽培大豆和18份野生大豆对GmMAX1基因进行重测序,结果共检测到30个核苷酸多态性位点,包括22个SNP和8个INDEL,其中有三个导致氨基酸变化。在参试材料中,这些多态性位点共组成15种单倍型,野生和栽培大豆分别有13和6种单倍型,其中H1、H3为栽培大豆优势单倍型。野生和栽培大豆的Tajima’sπ值分别为0.00785和0.00226,表明野生大豆具有更高的基因多样性。（2）CCD7和CCD8基因控制独脚金内酯合成中相邻两步生化反应。根据CCD蛋白家族信息,鉴定出大豆全基因组的全部9条类胡萝卜素裂解双加氧酶候选基因序列。这些基因分布在大豆基因组的8个染色体上,主要分为NCED、CCD1、CCD7和CCD8四个亚进化枝,相同的CCD基因亚家族内有类似的保守模体和基因结构。CCD基因家族成员经历了不同的进化命运。通过对基因保守性的计算,推测Gm12g36530和Gm08g10190分别是大豆控制类胡萝卜色素和脱落酸合成的主要基因；根据结构将NCED分为两类,一类控制脱落酸,另外一类的功能尚不明确。进一步对包括大豆在内的11种模式植物的CCD7和CCD8基因序列进行分子进化分析。结果来自单子叶、双子叶和苔藓植物的序列明显分类。这两个基因十分保守,在被子植物中具有类似的分子进化特征。根据CCD7和CCD8调控独脚金内酯合成紧密相连两个化学过程的特点,应用分子钟理论,以单子叶植物与双子叶植物的分化时间作为参照点,推测独脚金内酯产生于3.6亿年前,这与前人计算的植物与真菌开始共生的时间相吻合。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词及英汉对照
• 第一章 文献综述
• 1 独角金内酯的结构与作用特点
• 1.1 独角金内酯的结构特点
• 1.2 独角金内酯抑制植物分枝
• 1.3 独角金内酯促进枞枝菌菌丝的分枝
• 2 独脚金内酯代谢途径主要基因研究进展
• 2.1 独脚金内酯代谢及调控
• 2.2 植物CCD基因家族研究进展
• 3 重测序与分子进化研究的重要方法
• 3.1 生物多样性与基因重测序研究进展
• 3.2 基因组学与分子进化研究进展
• 3.3 分子钟
• 4 植物茎分枝及大豆株型改良研究进展
• 4.1 植物茎分枝的发育与调控机理
• 4.2 大豆株型改良研究进展
• 4.3 本研究的目的与意义
• 第二章 GMMAX1的转基因功能验证
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料、主要仪器及试剂
• 1.2 总RNA的提取、cDNA第一链的合成以及GmMAX1基因的克隆
• 1.3 过表达载体构建
• 1.4 拟南芥春化、种植与转化拟南芥
• 1.5 转基因拟南芥的验证
• 1.6 荧光定量PCR
• 2 结果与分析
• 2.1 GmMAX1基因的结构特点
• 2.2 GmMAX1基因的克隆和植物表达载体的构建
• 2.3 转基因拟南芥的验证与性状调查
• 第三章 GMMAX1基因的重测序与基因多样性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 大豆种植与分枝性调查
• 1.2 大豆基因组DNA提取,目标片段的获得和测序
• 1.3 数据分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 GmMAX1基因序列的多态性
• 2.2 GmMAX1序列单倍型分析
• 2.3 连锁不平衡分析
• 3 讨论
• 第四章 大豆CCD基因家族的全基因组分析与分子进化
• 1 材料与方法
• 1.1 序列收集与共线性分析
• 1.2 系统进化分析
• 1.3 保守模体搜索和基因结构预测
• 1.4 正选择分析
• 2 结果与分析
• 2.1 大豆与拟南芥CCD家族候选基因的鉴定与结构分析
• 2.2 共线性分析
• 2.3 系统进化分析
• 2.4 保守模体搜索和基因结构预测
• 2.5 正选择分析
• 3 讨论
• 第五章 独脚金内酯合成途径相邻基因CCD7与CCD8的分子进化分析
• 1 材料与方法
• 1.1 序列收集与基因结构预测
• 1.2 系统进化分析
• 1.3 正选择分析
• 1.4 计算碱基同义置换率和CCD7与CCD8的分化时间
• 2 结果与分析
• 2.1 序列收集与基因结构预测
• 2.2 系统进化分析
• 2.3 正选择分析
• 2.4 计算碱基同义置换率和CCD7与CCD8的分化时间
• 3 讨论
• 全文结论
• 本研究创新之处
• 参考文献
• 附录
• 致谢