论文摘要
酶的人工模拟,对认识酶自身生物进化过程和酶结构与功能关系有着十分重要的作用。谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）是机体内重要的含硒酶,其催化基团为硒代半胱氨酸,以谷胱甘肽（GSH）为底物分解体内的氢过氧化物,清除自由基,从而保护细胞免遭氧化损伤。随着近年来自由基致病理论的建立和发展,GPx的作用逐渐引起人们重视,成为研究的热点。酶催化的基石是底物结合和分子内催化。因此构建人工酶的关键在于酶模型能识别和结合底物,催化官能团布局合理。本文根据所在小组所提出的人工模拟酶策略,在所选择的模型上,引入酶的催化基团,并构建合适的底物结合部位,利用化学和生物学的方法和原理,制备出两个高GPx活力的人工酶。另外还研究了本实验室构建的含硒单链抗体酶活性部位的结构。1.构建含硒生物印迹酶模拟GPx我们将枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）转变为硒化枯草杆菌蛋白酶（selenosubtilisin）,以硒化枯草杆菌蛋白酶为起始蛋白,印迹分子为谷胱甘肽（GSH）,采用生物印迹技术,以共价键将一个底物连接到模板分子上,得到GSH-硒化枯草杆菌印迹酶（imprinted GSH-selenosubtilisin）,简称印迹酶。其催化GSH还原H2O2的最高活力和平均活力分别为597U/μmol和462U/μmol,比硒化枯草杆菌蛋白酶活力提高了100多倍,是Ebselen活力的500倍。印迹酶的催化机制与天然酶类似属于乒乓机制。印迹酶高活力的原因是:该模拟物是直接具有底物GSH结合部位的含硒印迹酶,首次实现了催化基团硒代半胱氨酸与底物结合部位的合理定位。2.构建环糊精模型模拟GPx在小组原有6-SeCD模拟物的基础之上,改造出一个新的活力提高的GPx模拟物:6A,6B-环己胺基- 6A’ ,6B’ -硒桥联-β-CD（6-CySeCD）。6-CySeCD模拟物催化GSH还原H2O2活力为7.9 U/μmol,比Ebselen的催化效率高7.9倍,比原模拟物6-SeCD（4.2 U/μmol）高1.8倍。其催化机制与天然酶类似。应用过氧化氢损伤Wistar大鼠乳鼠的背部表皮细胞为模型,研究了6-CySeCD的抗氧化能力。6-CySeCD活力的提高在于环己胺的定向引入。3.含硒单链抗体酶活性部位研究本实验室近年来设计并制备了几种谷胱甘肽过氧化酶模拟物,其中单链抗体GPx模拟酶（Se-scFv-2F3）就是其中之一。该酶是从含硒抗体酶（Se-Ab-2F3）出发,通过蛋白质工程和化学修饰相结合的方法将Se-Ab-2F3改造成为Se-scFv-2F3的。迄今,对Se-scFv-2F3的活性部位结构知之甚少。该酶的计算机模拟模型显示,SerH52和SerH59位于单链抗体的疏水性空腔内部,该空腔为谷胱甘肽的结合位点,因此这两个丝氨酸在进行硒化学修饰后,都极有可能成为该模拟酶的催化中心。本实验通过重叠PCR的方法,分别将SerH52和SerH59突变为Ala,获得两个突变体,比较其与原单链抗体的活性差异,从而判断单链抗体的活性位点的具体部位。
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标签：谷胱甘肽过氧化物酶论文; 分子印迹论文; 环糊精论文; 单链抗体酶论文; 人工酶论文;