稀有鮈鲫和泥鳅部分基因的克隆及其表达模式

论文摘要

本项目以稀有鮈鲫和泥鳅为对象，克隆了稀有鮈鲫和泥鳅的肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因，并对其表达模式进行了初步研究；同时，克隆了稀有鮈鲫β-肌动蛋白基因，为进一步研究鱼类肌肉生长发育调节机制打下了基础。肌肉生长抑制素是转化生长因子β家族成员之一，是动物肌肉生长发育的负调控因子，抑制肌肉的发育和生长。鱼类MSTN的研究将有助于了解肌肉发育及其调控机理，促进渔业生产和发展。1．以稀有鮈鲫为主要研究对象，通过RT-PCR和RACE的方法，从稀有鮈鲫肌肉组织的SMART cDNA文库中克隆出MSTN全长基因。与其它已知的MSTN比对，同源性非常高，达54％-97％，并基于已知的MSTN氨基酸系列构建了进化树。稀有觞鲫的MSTN基因的cDNA全长2184bp，含有1128bp的开放阅读框，编码375个氨基酸。分析表明，其蛋白质具有两个典型的TGF-β蛋白结构域，一个是TGF-β前肽结构域；从第99位到第255位，共157个氨基酸。另一个是TGF-β结构域，是TGF-β家族基因的活性结构域，从第281位至第375位，共95个氨基酸。稀有鮈鲫的MSTN蛋白具有典型的RXXR蛋白酶水解位点（RIRR），位于第263-266位；另有9个保守的半胱氨酸残基。信号肽预测发现该蛋白属于分泌性蛋白。采用RT-PCR方法进行了稀有鮈鲫MSTN基因的时空表达模式特征分析，结果表明，稀有鮈鲫MSTN在肌肉和眼睛中表达；而在其他被检测的部位如：脑、鳃、心脏、肠、卵巢、肝、精巢中未检测到。说明鱼类MSTN基因可能除了抑制肌肉生长发育以外，对眼的发育也有一定的作用。2．以泥鳅肌肉cDNA为模板，采用RT-PCR方法克隆了泥鳅MSTN基因的主要片段：其长度为815bp，编码271个氨基酸残基。克隆的泥鳅MSTN基因已近完整的阅读框架（ORF），包含了MSTN前肽结构域、MSTN功能结构域、保守的蛋白酶水解位点RIRR和7个保守的半胱氨酸残基等主要功能片段。泥鳅MSTN与鲤MSTN同源性高达94％，与斑马鱼MSTN同源性达92％。不同组织的RT-PCR分析表明该基因在肌肉中强烈表达，在眼中也有微弱表达，而在其他所检测组织（脑、鳃、心脏、肝脏、肠、精巢、卵巢）中未见表达。与稀有鮈鲫MSTN的表达模式一致。3．β-actin基因是真核生物中普遍存在，是进化中高度保守的蛋白质家族，与一些管家基因一样，在物种内持续恒量表达，因而在很多需量化的实验技术，如RT-PCR、PCR、Northern杂交中被当作内参照。本研究采用RT-PCR方法从稀有鮈鲫肌肉组织中分离和克隆出β-肌动蛋白基因cDNA部分序列，长度为1029bp，编码343个氨基酸残基。序列分析表明，该cDNA序列与其他物种β-肌动蛋白基因同源性非常高。RT-PCR能够检出该基因在稀有鮈鲫肌肉、眼、脑、心脏、肝、肠、鳃、睥、卵巢等组织中广谱表达，在胚胎不同发育时期持续恒量表达。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 1.文献综述
• 1.1 稀有鮈鲫胚胎发育过程
• 1.2 肌肉分化分子调控
• 1.3 MSTN基因的研究进展与展望
• 1.3.1 MSTN的研究概况
• 1.3.2 MSTN的时空表达特征
• 1.3.3 MSTN的作用与表达的调节
• 1.3.4 MSTN基因的作用机理
• 1.4 β-肌动蛋白基因研究简述
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2.材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要仪器设备
• 2.3 主要试剂
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 实验鱼的处理
• 2.4.2 RNA的提取
• 2.4.2.1 采用Trizol试剂提取稀有鮈鲫和泥鳅肌肉组织总RNA
• 2.4.2.2 采用SV Total RNA Isolation Kit试剂盒提取不同发育时期的胚胎和各组织总RNA（用于RT-PCR检测MSTN表达的时空模式）
• 2.4.3 cDNA第一链的合成
• 2.4.4 RT-PCR扩增基因cDNA片段
• 2.4.5 纯化PCR产物
• 2.4.6 E.coli感受态的制备
• 2.4.7 目的DNA片段与pMD 18-T载体的连接
• 2.4.8 转化
• 2.4.9 RACE-PCR克隆基因全长
• 2.4.10 序列分析
• 2.4.11 用RT-PCR研究基因的表达
• 3.结果
• 3.1 稀有鮈鲫MSTN基因cDNA的克隆
• 3.1.1 稀有鮈鲫MSTN基因片段的克隆
• 3.1.2 RACE-PCR扩增稀有鮈鲫MSTN基因5’端
• 3.1.3 RACE-PCR扩增稀有鮈鲫MSTN基因3’端
• 3.1.4 稀有鮈鲫MSTN基因的cDNA序列分析
• 3.1.5 稀有鮈鲫MSTN基因组DNA中一内含子序列
• 3.1.6 稀有鮈鲫MSTN蛋白的信号肽预测
• 3.1.7 同源性分析
• 3.1.8 进化树构建
• 3.1.9 稀有鮈鲫MSTN基因时空表达特征分析
• 3.1.9.1 稀有鮈鲫MSTN基因组织表达RT-PCR分析
• 3.1.9.2 稀有鮈鲫MSTN基因在不同胚胎发育阶段的RT-PCR分析
• 3.2 泥鳅MSTN基因cDNA的克隆及表达分析
• 3.2.1 泥鳅MSTN基因片段的扩增和克隆
• 3.2.2 泥鳅MSTN基因片段与其他鱼同源性分析
• 3.2.3 泥鳅MSTN基因的组织表达分析
• 3.3 稀有鮈鲫β-actin基因片段的克隆
• 3.3.1 稀有鮈鲫β-actin基因片段的克隆及序列分析
• 3.3.2 同源性比较
• 3.3.3 系统发育分析
• 3.3.4 稀有鮈鲫β-actin的时空表达分析
• 4.讨论
• 4.1 稀有鮈鲫和泥鳅MSTN基因特征
• 4.2 稀有鮈鲫和泥鳅MSTN基因组织表达特征
• 4.3 稀有鮈鲫β-actin基因特征
• 参考文献
• 附录
• 在校期间论文发表情况
• 致谢