水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究

论文摘要

本试验主要探索了水牛MⅡ期卵母细胞及GV期卵母细胞的玻璃化冷冻保存方法。探讨水牛MⅡ期卵母细胞冷冻保存的方法,通过对3种抗冻保护剂组合（Ⅰ:20%乙二醇+20%二甲基亚砜;Ⅱ:20%乙二醇+20%1,2-丙二醇;Ⅲ:20%乙二醇+20%1,2-丙二醇+10%二甲基亚砜）的毒性试验,发现实验组的形态正常率均低于对照组（未处理组）（P＜0.05）;Ⅰ组的孤雌激活效果与对照组没有显著差异（P＞0.05）;Ⅱ组体外受精后分裂率明显低于对照组（P＜0.05）,但8-细胞率和囊胚率与对照组没有显著差异（P＞0.05）。在此基础上,以抗冻保护剂Ⅰ组做冷冻液,探讨了解冻液中蔗糖梯度浓度（A:0.5M-0.25M-0.10M与B:0.62M-0.42M-0.31M）对解冻效果的影响。A、B两组的形态正常率和孤雌激活后续发育能力均比对照组低（P＜0.05）,其中B组的分裂率和囊胚率相似于对照组。其次,比较了3种抗冻剂组合的冷冻效果。解冻后实验组的形态正常率和孤雌激活后的发育能力均低于对照组（P＜0.05）,但Ⅰ组的囊胚率对照组和其他两个实验组没有显著差异（P＞0.05）。经体外受精后的发育能力也低于对照组,且Ⅰ组分裂率明显低于Ⅱ组（P＜0.05）。选出最佳抗冻剂组合后,探讨了GMP、CLV和半麦管法的冷冻效果。冻后卵母细胞的形态正常率及分裂率、8-cell率均低于对照组（P＜0.05）,而实验组间没有显著差异。GMP法囊胚率与对照组相似（P＞0.05）,而其他两种方法显著较低（P＜0.05）。此外,还探讨了冷冻液和解冻液中分别添加蔗糖或海藻糖对冷冻效果的影响。解冻后,实验组的形态正常率及孤雌激活后8-细胞之后的发育能力均低于对照组（P＜0.05）,但实验组间无显著差异（P＞0.05）。其中,添加蔗糖组的分裂率显著低于对照组。利用优化后的卵母细胞冷冻液和冷冻方法,探讨了水牛GV期卵母细胞的冷冻效果。结果表明,GV期冻后卵母细胞的形态正常率,及孤雌激活的后续发育潜力均明显低于未冷冻组（P＜0.05）。而在进一步探讨不同发育阶段的水牛卵母细胞冷冻保存效果中发现,GV期卵母细胞的形态正常率,体外成熟后的孤雌激活分裂率和8-细胞率显著低于MⅡ期（P＜0.05）。以上结果表明:1.三种冷冻玻璃化液均可用于冷冻水牛MⅡ期卵母细胞;2.水牛MⅡ期卵母细胞解冻时采用浓度梯度依次为0.62M、0.42M和0.31M的海藻糖解冻液去除防冻剂可取得较好的冷冻保存效果;3.玻璃微细管法、铜环法和半麦管法均可用于水牛MⅡ期卵母细胞的保存,其中玻璃微细管法冷冻效果最好;4.水牛GV期卵母细胞冷冻的效果比MⅡ期差。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 一、前言
• 二、哺乳动物卵母细胞冷冻保存的研究进展
• 1.家畜卵母细胞冷冻保存的原理
• 2.抗冻保护剂
• 3.冷冻保存方法
• 4.冷冻保存对卵母细胞发育潜力的影响
• 第二部分 试验研究
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 溶液配制
• 1.3 卵母细胞的来源
• 1.4 卵母细胞的成熟培养
• 1.5 颗粒细胞单层的制备
• 1.6 冷冻载体的制备
• 1.7 卵母细胞的玻璃化冷冻及解冻
• 1.8 卵母细胞冷冻效果的评价
• 1.9 实验设计
• 1.10 统计分析
• 2.结果与分析
• 2.1 水牛MⅡ期卵母细胞冷冻保存
• 2.2 水牛GV期卵母细胞的冷冻保存
• 2.3 不同发育阶段的水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存效果
• 3.讨论
• 3.1 抗冻保护剂对卵母细胞的毒性作用
• 3.2 抗冻保护剂组合对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻效果的影响
• 3.3 不同玻璃化冷冻方法对水牛Ⅱ卵母细胞冷冻效果的影响
• 3.4 添加非渗透性抗冻剂对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻效果的影响
• 3.5 水牛GV期卵母细胞的冷冻效果
• 4.结论
• 参考文献
• 英文缩写——中文对照表
• 图片与说明
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录