抗菌肽LfampinB/LfcinB基因的设计合成及表达产物的活性鉴定

论文摘要

乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）最初是从牛乳中发现的,具有抗菌、抗病毒、消除炎症和免疫调节等多种生物学功能。牛乳铁素（Bovine Lactoferricin,LfcinB）和牛Lactoferampin（LfampinB）是bLF N1端在空间结构上靠近的两个活性区域,由蛋白酶在水解条件下产生,抗菌活性都强于bLF。目前有研究证实,LfampinB与LfcinB组成的嵌合结构肽的抗菌作用比两者任一都强。因此,嵌合结构肽在替代传统抗生素方面将会有广阔的应用前景。本文旨在通过构建LfampinB/LfcinB高效表达载体,分别利用原核表达与真核表达的方式制备出抗菌肽,用于疾病的防治。根据LfampinB和LfcinB的结构特点及它们的抗菌机制,设计合成了LfampinB/LfcinB重组基因序列。将LfampinB/LfcinB基因与pPL-SD质粒连接构建中间载体,并在此基础上构建了pME290-SDLfa/Lfc原核表达载体。利用毕赤酵母系统中分泌型表达载体pPIC9K的多克隆位点,将合成的重组LfampinB/LfcinB基因克隆后插入pPIC9K载体,经限制性内切酶鉴定、PCR检测和测序分析正确后,成功构建真核表达载体pPIC9K-Lfa/Lfc。将重组质粒pME290- SDLfa/Lfc转化绿脓杆菌感受态细胞表达,离心收集上清,浓缩后经SDS-PAGE分析,结果在约16kDa的位置有目的条带,表明构建的原核表达系统表达出目的蛋白。真核表达载体pPIC9K-Lfa/Lfc转化酵母宿主菌GS115,筛选到G418高抗性的甲醇利用型（Mut+）转化子。研究发现,经0.5～1.0%甲醇诱导发酵72h,LfampinB/LfcinB融合蛋白可大量表达并分泌到培养物上清液中,SDS-PAGE分析目的蛋白大小约为10kDa,且经凝胶薄层扫描测定LfampinB /LfcinB融合蛋白表达量为0.23mg/mL。对原核表达与真核表达产生的融合蛋白作抗菌试验,结果发现原核表达产生的融合蛋白抗菌作用不明显,真核表达产生的融合蛋白对细菌6个属中的大肠杆菌、坏死梭杆菌、魏氏梭菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌10个菌株均有抗菌活性。本项研究研制出的LfampinB/LfcinB融合蛋白有望成为安全、有效、广谱的抗菌新药。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 研究背景及意义
• 1.2 乳铁蛋白、乳铁素以及Lactoferampin 的研究进展
• 1.2.1 乳铁蛋白、乳铁素以及Lactoferampin 的发现
• 1.2.2 乳铁蛋白、乳铁素以及Lactoferampin 的分子结构
• 1.2.3 乳铁蛋白、乳铁素和Lactoferampin 的生物学功能及抗菌机制
• 1.2.4 乳铁蛋白、乳铁素和Lactoferampin 的应用现状及前景
• 1.3 研究内容
• 第2章 LfampinB/LfcinB 基因表达载体的构建及其融合蛋白的表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要试剂和仪器
• 2.1.2 试剂的配制
• 2.1.3 培养基的配制
• 2.1.4 感受态细胞的制备
• 2.1.5 引物设计
• 2.1.6 LfampinB/LfcinB 基因的设计与合成
• 2.1.7 重组pGE-LfampinB/LfcinB 质粒的制备
• 2.1.8 LfampinB/LfcinB 基因的鉴定
• 2.1.9 LfampinB/LfcinB 基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达
• 2.1.10 LfampinB
• 2.2 结果
• 2.2.1 原核表达载体的构建及目的蛋白的表达
• 2.2.2 真核表达载体的构建及目的蛋白的诱导表达
• 2.3 讨论
• 第3章 LfampinB/LfcinB 融合表达蛋白体外抑菌作用及效价评定
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 仪器、试剂和菌种
• 3.1.2 试剂及培养基配制
• 3.1.3 LfampinB/LfcinB 融合蛋白抗菌活性的初步检测
• 3.1.4 LfampinB/LfcinB 融合蛋白表达量的测定
• 3.1.5 LfampinB/LfcinB 融合蛋白抗菌作用及效价评定
• 3.2 结果
• 3.2.1 LfampinB/LfcinB 融合蛋白初步抗菌活性
• 3.2.2 LfampinB/LfcinB 融合蛋白表达量
• 3.2.3 LfampinB/LfcinB 融合蛋白的抗菌作用
• 3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间所发表的学术论文
• 致谢