褪黑素对大鼠肝纤维化的保护作用及其对NF-κB活性的影响

论文摘要

背景/目的肝纤维化是慢性肝病共有的病理特征,其过程涉及到多细胞、多分子事件,最终导致胶原和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）.在狄氏间隙沉积,并能发展为不可逆性肝硬化。近年来的研究证实,肝纤维化在未进入肝硬化之前,尚有逆转可能。在此阶段,如果处理得当,肝硬化有可能避免。然而,目前尚无理想的治疗肝纤维化药物。因此,探讨肝纤维化的机理,开发有效和毒副作用小的治疗肝纤维化的新药是目前研究的重要方向。目前有证据提示,氧化应激在肝纤维化的发生和发展中起重要作用。褪黑素（N-acetyl-5-metyoxytryptamine, melatonin）是松果体分泌的一种激素,为强大的内源性抗氧化剂,能清除氧自由基和中间活性体。体内和体外实验显示,在由黄樟素、脂多糖（LPS）、四氯化碳（CCl4）、缺血再灌注、淀粉状蛋白质、电离辐射等诱导的氧化损伤中,褪黑素具有保护细胞、组织和器官的作用。另外,褪黑素还通过提高谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）这些潜在性的抗氧化剂的水平而间接发挥抗氧化作用。近年研究显示,褪黑素具有减少纤维母细胞增殖、抑制胶原合成作用。但褪黑素对肝纤维化的保护作用研究尚少。核转录因子кB（Nuclear factor-kappaB ,NF-кB）是由二聚体构成的转录因子家族,具有调控炎症、免疫、创伤愈合、细胞生存、细胞功能等作用。生理应激、氧化应激、暴露于某些化学品均可导致NF-кB激活,进而发挥其关键性的应激反应调节作用。NF-кB过度激活与许多疾病有关。近来NF-кB在肝脏疾病中的功能和调控受到关注,肝脏的损伤和纤维增生涉及到NF-кB的活化。NF-кB在肝纤维化中的确切作用尚不甚清楚,褪黑素对纤维化肝脏中NF-кB活性的影响及其后果未见系统研究。本课题在建立大鼠CCl4诱导的化学性肝纤维化模型基础上,探讨MEL对肝纤维化的抑制作用和可能机制。同时,探讨NF-кB在CCl4诱导的化学性肝纤维化中的作用,以及MEL是否通过抑制NF-кB活性而发挥抗纤维化作用。方法采用四氯化碳（carbon tetrachloride ,CCl4）制备SD大鼠化学性肝纤维化模型。所有大鼠随机分为6组:正常对照组（normal control group,normal组,11只）、模型对照组（model control group, model组,20只）、CCl4+N-乙酰-L-半胱氨酸组（NAC组,为阳性药对照,20只）、CCl4+低剂量褪黑素组（MEL1组,20只）、CCl4+中剂量褪黑素组（MEL2组,20只）、CCl4+高剂量褪黑素组（MEL3组,20只）。将CCl4与精制花生油按2 :3比例配成40%CCl4油剂溶液,除正常对照组外,余按3ml/kg给大鼠皮下注射,每周两次,连续12周,正常对照组注射等容量花生油作为对照。自动物皮下注射CCl4之日起,开始给药, NAC 100 mg/kg, i.p.,每天1次;MEL低、中、高剂量组分别给予MEL 2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg,均为腹腔注射。12周实验结束后,所有动物予以麻醉,腹主动脉取血,取出肝脏并称湿重。HE染色和Van Gieson （VG）胶原纤维染色观察肝脏病理改变;全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase ,AST）、白蛋白（albumin, A）、球蛋白（globulin, G ）水平;生化法测定肝脏羟脯氨酸（hydroxyproline ,Hyp）、丙二醛（malondialdehyde ,MDA）含量和谷胱甘肽过氧化物酶活性（glutathione peroxidase ,GPx）;放射免疫法测定血清透明质酸（hyaluronic acid,HA）、层粘连蛋白（laminin,LN）、三型前胶原氨端肽（procollagenⅢN-terminal peptide,PⅢN P）含量;免疫组化法测定肝组织中NF-кB P50、NF-кB P65、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、细胞间粘附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）的表达;RT-PCR法测定肝组织中Ⅰ型前胶原（procollagen typeⅠ）mRNA表达;电泳迁移率改变分析（electrophoretic mobility shift assay ,EMSA）测定肝组织中NF-кB DNA结合活性;同时,用原位灌注加密度梯度离心法分离正常SD大鼠肝脏星状细胞,以免疫组化法鉴定（用desmin抗体）,在培养的肝星状细胞中加入脂多糖（LPS）进行刺激,用MTT法测定不同浓度的MEL对肝星状细胞增殖的抑制作用。结果1. MEL对大鼠化学性肝纤维化的保护作用通过12周皮下注射CCl4,成功建立了大鼠肝纤维化模型。病理分级显示:正常对照组和CCl4处理各组之间差异显著（P < 0.01）,和模型组相比,MEL（10 mg/kg）组肝纤维化程度较轻,有统计学意义（P < 0.05）,表明MEL（10 mg/kg）有抑制肝纤维化作用。与正常对照组比较,CCl4处理各组血清ALT、AST水平显著升高（P < 0.01）,与模型组比较,MEL（5, 10 mg/kg）能显著降低升高的的ALT、AST水平（P < 0.05,P < 0.01）,NAC也能显著降低升高的ALT、AST水平（P < 0.05）,其作用强度和MEL相近。同样,与模型组比较,MEL（10 mg/kg）能降低肝脏Hyp含量和LN、HA水平,表明MEL对纤维化标志物的改善。另外,MEL对氧化应激指标也有明显影响,和模型组比较,MEL（5, 10 mg/kg）能显著降低肝匀浆MDA含量（P < 0.05）,升高GPx活性（P < 0.05,P < 0.01）,NAC也有同样作用,其作用强度和MEL（10 mg/kg）相近。2. MEL对LPS介导的肝星状细胞增殖的影响通过原位灌注和密度梯度离心法成功分离并纯化大鼠肝星状细胞,刚分离的星状细胞纯化至70-80%,存活率在90 %以上,纯化的星状细胞得率2×107/肝。传第一代的细胞,S-P法作免疫细胞化学鉴定,Desmin表达阳性细胞为90%以上。与对照组（无LPS刺激）相比,培养的肝星状细胞经LPS（10ng/ml）刺激后,增殖明显加快,与LPS组相比, MEL（0.1mmol/L）能显著抑制由LPS刺激的肝星状细胞增殖。3. MEL对纤维化大鼠肝组织I型前胶原mRNA表达的影响正常对照组大鼠肝组织I型前胶原mRNA表达较少,和CCl4处理各组相比,差异显著（P<0.05,P<0.01）。和模型组相比,MEL（10 mg/kg）组、NAC组表达明显减少（P<0.05）,MEL（2.5 mg/kg, 5 mg/kg）表达有下降趋势,但无统计学意义。这些结果表明MEL有抑制肝脏纤维化大鼠I型前胶原mRNA表达作用。4. NF-кB在CCl4诱导的大鼠肝纤维化中的作用以及MEL对NF-кB信号通路的影响NF-кB P65、NF-кB P50在正常对照组大鼠肝组织中仅有微量表达,表现为细胞浆中淡黄色颗粒,较之正常对照组,CCl4处理各组表达明显增强,表现为棕黄色和/或棕褐色颗粒,且细胞浆和细胞核中均有表达,和模型组相比,MEL（5, 10 mg/kg）、NAC均能显著降低NF-кB P65、NF-кB P50的表达。进一步, NF-кB DNA结合活性被测定,结果显示,正常对照组NF-кB结合活性较弱,模型组NF-кB结合活性较其它各组明显增强,和模型组相比,MEL能明显抑制NF-кB的结合活性。TNF-α、ICAM-1在正常对照组大鼠肝组织中仅很微量表达,表现为细胞浆中淡黄色颗粒,较之正常对照组,CCl4处理各组表达明显增强,表现为棕黄色和/或棕褐色颗粒,以血管周围,汇管区炎性细胞较多的区域最为明显,其表达强度弱于NF-кB P65、NF-кB P50,和模型组相比,MEL（10 mg/kg）、NAC均能显著降低TNF-α、ICAM-1的表达。结论1.连续12周CCl4皮下注射成功复制出大鼠肝纤维化模型,该模型具有典型肝纤维化病理表现,同时符合有关血液、肝组织生化检查改变,适合药物防治肝纤维化的实验研究。2.MEL具有保护肝细胞、抑制肝纤维化作用,这种作用考虑与其抗氧化有关。3.NF-кB与肝纤维化关系密切,其表达和DNA结合活性与肝纤维化程度一致,在肝纤维化的发展中起重要作用。4.MEL保护肝细胞、抑制肝纤维化作用可能部分地与其抑制NF-кB活化,下调NF-кB信号通路有关。以上结果将为开发MEL作为防治肝纤维化药物提供实验基础。

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1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 药物及试剂

2.1.3 部分试剂配制

2.2 仪器与设备

2.3 实验方法

2.3.1 大鼠肝纤维化模型制备

2.3.1.1 动物分组

2.3.1.2 动物模型制备

2.3.1.3 给药方案

2.3.2 动物处理和标本制备

2.3.3 大鼠血清生化检测

2.3.4 病理学检查

2.3.4.1 肝组织固定、切片、染色

2.3.4.2 肝纤维化病理分级判定标准

2.3.5 MDA 含量测定、GPx 活性测定

2.3.5.1 MDA 的测定（TBA 法）

2.3.5.2 GPX 测定

2.3.6肝组织羟脯氨酸（hydroxyproline,Hyp）含量测定

2.3.7 血清血清LN、HA、PⅢ NP含量测定

2.3.7.1 LN放射免疫分析法

2.3.7.2 HA放射免疫分析法

2.3.7.3 PⅢNP放射免疫分析法

2.3.8 免疫组化检测

2.3.8.1 NF-кB P50 免疫组化检测方法

2.3.8.2 NF-кB P65 免疫组化检测方法

2.3.8.3 TNF-α免疫组化检测方法

2.3.8.4 ICAM-1（CD54）免疫组化检测方法

2.3.8.5 免疫组化评分标准

2.3.9 RT-PCR检测肝组织α1（I）型前胶原mRNA的表达

2.3.9.1 总RNA提取

2.3.9.2 以RNA为模板逆转录cDNA

2.3.9.3 PCR扩增

2.3.10 EMSA检测肝组织NF-κB结合活性

2.3.10.1 胞浆和核蛋白提取

2.3.10.2 蛋白定量

2.3.10.3 电泳迁移率改变分析实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）

2.3.11 MEL 对大鼠 HSC 增殖的影响

2.3.11.1 肝星状细胞分离培养

2.3.11.2 星状细胞纯度及活力鉴定

2.3.11.3 肝星状细胞免疫组化鉴定

2.3.11.4 MTT 法检测MEL 和 LPS 对 HSC 增殖的影响

2.4 数据处理和统计学分析

3 结果

3.1 MEL 对 CCl4 诱导的肝纤维化大鼠的保护作用

3.1.1 大鼠体重、肝指数变化

3.1.2 MEL 对纤维化大鼠血清ALT、AST、A/G 的影响

3.1.3 MEL 对纤维化大鼠血清LN、HA、PⅢNP 含量的影响

3.1.4 MTL 对纤维化大鼠肝匀浆Hyp 含量的影响

3.1.5 MEL 对纤维化大鼠肝组织I 型前胶原mRNA 表达的影响

3.1.6 MEL 对纤维化大鼠肝脏病理组织学的影响

3.1.7 MEL 对纤维化大鼠肝匀浆 MDA、GPx 水平的影响

3.2 MEL 对大鼠肝星状细胞增殖的影响

3.2.1 大鼠肝星状细胞分离和培养

3.2.2 大鼠肝星状细胞鉴定

3.2.3 MEL 对脂多糖激活的大鼠肝星状细胞增殖的影响

3.3 MEL 对纤维化大鼠肝组织 NF-кB 通路表达的影响

3.3.1 MEL 对纤维化大鼠肝组织的 NF-кB P50 ,NF-кB P65 ,TNF-α,ICAM-1（CD54）表达的影响

3.3.2 MEL 对纤维化大鼠肝组织 NF-кB 结合活性的影响

4 讨论

4.1 大鼠肝纤维化模型的建立

4.2 MEL 对大鼠 CCl4 所致肝纤维化的改善作用

4.3 MEL 抗氧化作用：对纤维化大鼠肝脏MDA、GPx 水平的影响

4.4 MEL 抑制脂多糖诱导的大鼠肝星状细胞增殖

4.5 MEL 对纤维化大鼠肝组织I 型前胶原mRNA 表达的抑制作用

4.6 NF-кB 通路在肝纤维化形成过程中的作用

4.7 NF-кB 与 TNF-α及ICAM-1 关系

4.8 MEL 抑制 NF-кB 活性及对肝纤维化的影响

5 结论

参考文献

附录

致谢

NF-кB 在肝脏疾病中的作用

参考文献

褪黑素对大鼠肝纤维化的保护作用及其对NF-κB活性的影响

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