油菜素内酯诱导矮秆突变体对大豆疫霉根腐病抗性研究

论文摘要

大豆是人类的主要植物蛋白来源,但大豆的生产和产量的提高受到大豆秆高和疫霉菌（Phytophthora sojae）根腐病的严重制约。因此,大豆矮化、疫霉菌根腐病的有效防治一直是国内外热门的研究课题。油菜素内酯（Brassinosteroids,简称BR）是一类新型植物激素,在植物抗冷性、抗旱性、抗盐性、抗除草剂、抗病害等抗逆生理过程中起重要作用。本研究以BR、疫霉根腐病抗性和感病大豆品种、大豆矮秆突变体及其野生型为试验材料,研究BR对大豆疫霉根腐病抗性的诱导作用以及诱导后的主要抗病相关酶、蛋白质组的变化。目的是探讨BR在大豆疫霉根腐病诱导抗性中的应用前景和BR诱导抗性的可能分子机制。主要结果如下:1、对BR处理后的大豆幼苗测定结果表明,不论是抗病还是感病品种,其抗病相关酶类PAL和POD的活性都显著提高;最终发病率分析表明,BR处理能提高大豆幼苗对疫霉根腐病菌的抵抗能力,但诱导的抗病能力不如抗病的大豆品种,而且参试的矮秆突变体比其野生型对BR的诱导抗性更加敏感;2、蛋白质组的2D-PAGE分析发现,BR处理和不处理、矮秆突变体及其野生型的大豆幼苗叶片共检测到25个差异表达蛋白,但表达的蛋白种类基本相同。利用质谱鉴定技术初步鉴定15个差异蛋白,其大多数属于能量代谢、生长发育、光合作用和防卫相关蛋白,其中一些蛋白可能与抗病及矮化相关。3、对初步鉴定出的1差异蛋白开展相关基因克隆,得到RBCL基因片段。生物信息学分析表明,RBCL基因的编码蛋白是核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶,其全长为1420bp,含473个氨基酸残基。对比分析发现,野生型和突变体在该基因的克隆片段中的差异仅有两处,分别位于75bp和95bp处。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 油菜素内酯研究进展
• 1.1.1 BR 的生理功能及其分子生物学研究
• 1.1.2 油菜素内酯与植物矮化突变体的研究
• 1.1.3 BR 与其它植物激素的关系
• 1.1.4 BR 的抗逆性研究
• 1.2 大豆疫霉的分子生物学研究
• 1.2.1 PS 的无毒基因
• 1.2.2 PS 的分子鉴定
• 1.3 植物蛋白质组学研究进展
• 1.3.1 蛋白质组学在植物中的应用
• 1.3.2 大豆蛋白质组学研究进展
• 1.3.3 植物蛋白质组研究的局限性和策略
• 1.4 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料和试剂
• 2.1.1 主要试验材料
• 2.1.2 主要化学试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要试剂配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 接种体制备
• 2.2.2 大豆疫霉的接种方法
• 2.2.3 分析样本的准备
• 2.2.4 根腐病病情的调查方法
• 2.2.5 抗病相关酶系的测定
• 2.2.6 总蛋白的提取
• 2.2.7 大豆基因组 DNA 的提取
• 2.2.8 大豆 RNA 的提取及cDNA 合成
• 2.2.9 RBCL 基因的 PCR 扩增和测序
• 2.2.10 蛋白浓度定量
• 2.2.11 双向电泳
• 2.2.12 考马亮蓝染色
• 2.2.13 图象获取分析
• 2.2.14 胰蛋白酶消化
• 2.2.15 差异点的数据库检索
• 3 结果与分析
• 3.1 BR 对大豆防御酶的影响
• 3.1.1 BR 对过氧化物酶（POD）活性的影响
• 3.1.2 BR 对苯丙氨酸转氨酶（PAL）活性的影响
• 3.2 BR 对大豆疫霉根腐病的影响
• 3.3 BR 调控相关蛋白的分离和鉴定结果
• 3.3.1 探索性试验结果
• 3.3.2 BR 调控相关蛋白的差异分析结果
• 3.3.2.1 经BR 处理后的突变体与野生型幼苗之间的蛋白差异
• 3.3.2.2 野生型幼苗经BR 处理后不同时间的蛋白差异
• 3.3.2.3 突变体幼苗经BR 处理后不同时间的蛋白差异
• 3.4 差异蛋白的质谱分析与鉴定
• 3.5 大豆RBCL 基因片段的克隆
• 3.5.1 RBCL 基因的PCR 扩增及序列分析
• 3.5.2 RBCL 基因与其它植物的同源分析
• 3.5.3 结构预测分析
• 4 讨论
• 4.1 BR 与大豆的抗病性
• 4.2 关于大豆双向电泳体系的优化
• 4.3 关于BR 调控相关蛋白
• 4.4 RBCL 基因克隆分析
• 5 结论
• 6 需要进一步研究的问题
• 参考文献
• 附录1 蛋白浓度定量建立的标准曲线图
• 附录2 质谱图谱
• 附录3 MALDI-TOF-MS 检测时，常见的角蛋白肽谱峰
• 附录4 缩略词
• 致谢