扣囊复膜酵母海藻糖合成代谢的初步研究

论文摘要

海藻糖在生物圈内无处不在，其独特的物理化学特性使其成为细胞应激代谢物，在不同的逆境胁迫中保护生物大分子。海藻糖在工业中有极好的应用前景，如在干燥和冷冻期间维持细胞膜的完整性；增加多种不稳定物质的稳定性；提高冷冻细胞的生存能力；提高生物物质如酶、疫苗等的稳定性；在食品和制药工业中作为冷冻保护剂和高效保存剂等。 在本实验室前期工作中，从土壤中分离到一株能利用淀粉合成海藻糖的野生型扣囊复膜酵母菌株，该菌株在含淀粉的培养基中经48h发酵可积累占细胞干重18％的海藻糖，但细胞内海藻糖酶活力较高，分解合成的海藻糖，对海藻糖积累不利。本研究以该野生型酵母为出发菌株，经过EMS诱变，得到一株中性和酸性海藻糖酶活力均显著降低的突变株A11，突变株A11在含淀粉培养基中的生长能力并未下降，但经48h发酵，细胞内海藻糖的积累量却比野生型细胞提高了50％。 为了解扣囊复膜酵母A11海藻糖的合成代谢，通过实验确定了该菌株海藻糖的生物合成途径，结果表明其海藻糖合成途径与啤酒酵母和大肠杆菌的一样，即由UDP-葡萄糖与6-磷酸葡萄糖在6-磷酸海藻糖合成酶催化下合成6-磷酸海藻糖，然后由6-磷酸海藻糖磷酸酯酶催化下合成海藻糖。该合成途径的关键酶6-磷酸海藻糖合成酶经过超滤浓缩、Sepharose CL-4B和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析等系列纯化过程，经SDS-PAGE和Native-PAGE电泳检测，都呈现一条66kDa的条带，证实6-磷酸海藻糖合成酶被纯化，纯化倍数33倍，收率61％。SDS-PAGE和Native-PAGE电泳上显示的结果，说明扣囊复膜酵母6-磷酸海藻糖合成酶与啤酒酵母和其他真核生物的不同。 对纯化的6-磷酸海藻糖合成酶的生化特性进行研究表明，该酶反应的最适温度是37℃，最适pH 6.6，酶的温度和pH稳定性均很差；Ca2+、K+和Mg2+对酶活性有激活作用，最适激活浓度分别是10mmol／L、35mmol／L和35mmol／L，说明该酶是金属酶；而Cu2+，Fe3+，Hg2+，Co2+对酶活性有抑制作用，Hg2+对酶

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.本课题的研究背景和意义
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究的目的和意义
• 2.海藻糖的结构和理化性质
• 3.海藻糖的生物学功能
• 3.1 原核生物中海藻糖的生物学功能
• 3.2 酵母菌和其他丝状真菌中海藻糖的生物学功能
• 3.3 动物中海藻糖的生物学功能
• 3.4 植物中海藻糖的生物学功能
• 4.海藻糖的应激保护作用及作用机制
• 4.1 海藻糖的抗脱水作用
• 4.2 海藻糖对生物膜的保护作用
• 4.3 海藻糖对脂质体的保护作用
• 4.4 海藻糖对生物大分子的保护机制
• 5.海藻糖的代谢途径
• 5.1 海藻糖的生物合成途径
• 5.2 海藻糖分解代谢途径
• 6.海藻糖的代谢调控
• 6.1 大肠杆菌中海藻糖的代谢调控
• 6.2 酵母中海藻糖的代谢调控
• 7.海藻糖的应用
• 7.1 食品工业
• 7.2 保健品领域
• 7.3 医药工业
• 7.4 化妆品工业
• 7.5 精细化工
• 7.6 分子生物学研究
• 7.7 农业领域
• 8.海藻糖相关研究展望
• 8.1 海藻糖生物工程生产
• 8.2 运用分子生物学研究开发海藻糖制备新工艺
• 8.3 结合海藻糖晶体结构、物理构象和化学特性深入研究其保护作用机制
• 8.4 深入研究海藻糖的功能特性,进一步扩大在食品中的应用
• 第二章 扣囊复膜酵母海藻糖酶基因缺陷突变株的筛选
• 1.材料
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 2.方法
• 2.1 EMS诱变
• 2.2 突变株的筛选
• 2.3 海藻糖的测定
• 2.4 细胞浓度的测定
• 2.5 粗酶液的制备
• 2.6 酸性海藻糖酶（Ath1）酶活力的测定
• 2.7 中性海藻糖酶（Nth1）酶活力的测定
• 2.8 突变株和野生型菌株在YPS培养基中的生长量和海藻糖积累量的比较
• 2.9 突变株和野生型菌株中酸性和中性海藻糖酶活力的比较
• 3.结果与讨论
• 3.1 扣囊复膜酵母的海藻糖酶突变株的筛选
• 3.2 突变株A11和野生型菌株在YPS培养基中生长量的比较
• 3.3 突变株A11和野生型菌株在YPS培养基中海藻糖积累量的比较
• 3.4 突变株A11和野生型菌株酸性和中性海藻糖酶活力比较
• 4.本章小结
• 第三章 扣囊复膜酵母海藻糖合成途径的确定
• 1.材料和方法
• 1.1 菌种
• 1.2 试剂与培养基
• 1.3 细胞破碎方法的选择
• 1.4 粗酶液的制备
• 1.5 6-磷酸海藻糖合成酶活力的测定
• 1.6 海藻糖合酶活力的测定
• 1.7 总蛋白的测定
• 1.8 比活力的计算
• 1.9 还原糖的测定
• 1.10 培养基中葡萄糖浓度对海藻糖积累的影响
• 1.11 不同培养基对6-磷酸海藻糖合成酶活力和海藻糖积累的影响
• 1.12 6-磷酸海藻糖合成酶活力测定时最佳酶反应时间的确定
• 2.结果与讨论
• 2.1 细胞破碎方法的确定
• 2.2 扣囊覆膜酵母A11海藻糖生物合成途径的确定
• 2.3 葡萄糖对扣囊复膜酵母A11海藻糖合成的影响
• 2.4 A11在YPD和YPS培养基中的6-磷酸海藻糖合成酶活力和海藻糖含量
• 2.5 6-磷酸海藻糖合成酶酶活测定时最佳酶反应时间的确定
• 3.本章小结
• 第四章 扣囊覆膜酵母A11细胞内6-磷酸海藻糖合成酶的分离纯化及特性研究
• 1.材料
• 1.1 菌种 扣囊复膜酵母海藻糖酶缺陷突变株A11
• 1.2 试剂与培养基
• 2.方法
• 2.1 总蛋白的测定
• 2.2 粗酶液的制备
• 2.3 超滤浓缩
• 2.4 Sephrose CL-4B凝胶过滤
• 2.5 DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子交换
• 2.6 超滤浓缩收集液
• 2.7 不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.8 连续常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）
• 2.9 6-磷酸海藻糖合成酶活性测定
• 2.10 酶的最适反应温度和温度稳定性
• 2.11 酶的最适反应pH和pH稳定性
• 2.12 金属离子对酶活性的影响
• 2.13 各种化合物对酶活性的影响
• 2.14 Km值的测定
• 3.结果与讨论
• 3.1 6-磷酸海藻糖合成酶的分离与纯化
• 3.2 温度对6-磷酸海藻糖合成酶活性的影响
• 3.3 pH对6-磷酸海藻糖合成酶活性的影响
• 3.4 金属离子对酶活性的影响
• 3.5 不同化合物对酶活性的影响
• 3.6 酶的动力学常数
• 4.本章小结
• 第五章 6-磷酸海藻糖合成酶部分基因的克隆
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 扣囊复膜酵母基因组DNA的提取
• 1.3 引物设计
• 1.4 简并PCR扩增
• 1.5 PCR产物的回收
• 1.6 PCR产物的克隆
• 2.结果及分析
• 2.1 简并引物的设计原理
• 2.2 CoDeHOP简并引物的设计
• 2.3 简并PCR结果
• 2.4 PCR产物的克隆
• 2.5 6-磷酸海藻糖合成酶基因部分序列及推测的氨基酸序列的比对
• 2.6 扣囊复膜酵母β-actin部分基因的克隆
• 3.本章小结
• 第六章 不同逆境条件下海藻糖的积累和TPS1基因的表达
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 逆境胁迫试验
• 1.3 6-磷酸海藻糖合成酶活性的测定
• 1.4 总蛋白的测定
• 1.5 比活力的计算
• 1.6 海藻糖的测定
• 1.7 细胞干重的测定
• 1.8 RT-PCR引物设计
• 1.9 扣囊复膜酵母总RNA的抽提
• 1.10 总RNA的纯度和含量测定
• 1.11 RNA甲醛变性琼脂糖电泳
• 1.12 反转录
• 1.13 RT-PCR
• 2.结果与讨论
• 2.1 总RNA的质量
• 2.2 不同逆境胁迫对扣囊复膜酵母6-磷酸海藻糖合成酶活力和海藻糖积累的影响
• 2.3 不同逆境胁迫对扣囊复膜酵母6-磷酸海藻糖合成酶基因表达的影响
• 3.本章小结
• 结论、创新点与展望
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表和接收的论文
• 致谢