土壤中烟草青枯病菌分子检测方法研究

论文摘要

烟草青枯病（Tobacco bacterial wilt disease）是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum E.F.Smith）引起的严重危害世界烟草生产的毁灭性细菌病害。R. solanacearum是一种分布范围广、危害大且难以防治的土传病原细菌,其随植株病残体遗落于土壤中成为植物青枯病的主要侵染源。该病菌主要从根部侵入,然后通过维管束传播,在极短的时间内引起整个植株的枯萎、死亡。由于目前缺乏特效的药剂和抗性品种,烟草青枯病的病后治理难度相当大,因此在发生前快速、准确地检测潜伏在田间土壤中R. solanacearum的数量是预防该病害发生的有效策略之一。传统上烟草青枯病菌的检测方法在一定程度上存在着检测周期长、操作复杂、灵敏度不高的缺点,不能很好的满足检测工作的要求。随着分子生物学技术的发展,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）因其具有快速、特异、灵敏的特点已被广泛应用于病原微生物的检测。本研究即运用PCR技术,建立了土壤中R. solanacearum的常规PCR和实时荧光定量PCR（Real time PCR, RTi-PCR）检测体系,并初步研制出快速检测试剂盒。其研究成果将准确、快速地定量检测烟草种植田间土壤中的R. solanacearum和对田间病害发生情况进行动态监测,为烟草青枯病的防治提供有力依据,具有重要的生产意义和科学价值。论文主要研究结果如下:①建立了烟草青枯病菌的常规PCR检测体系。利用序列比对得到的R. solanacearum独有核苷酸序列设计特异性引物对R.sol1/R.sol2,对PCR反应条件进行优化,建立了常规PCR检测体系,其DNA扩增靶带为331 bp。该检测体系特异性强、灵敏度高,检测灵敏度可以达到100 fg/μL,可用于土壤中R. solanacearum的检测。②改进了土壤中微生物总基因组DNA的提取方法,解决了土壤中腐殖酸、腐殖酸样物、酚类化合物、重金属、不明沉淀物、菌体裂解成分和RNA等PCR抑制物质导致DNA不能直接用作PCR扩增模板的难题,采用此方法在2.5 h内提取得到可直接用于PCR扩增的高质量的土壤DNA。③首次建立了土壤中烟草青枯病菌的RTi-PCR检测体系。运用特异性引物对R.sol1/R.sol2优化建立了SYBR Green I RTi-PCR检测体系;利用引物探针设计软件设计TaqMan杂交探针RSprobe和特异性引物对R.sol1/R.sol2优化建立了TaqMan探针RTi-PCR检测体系;采用R.sol1/R.sol2扩增的331 bp片段构建的重组质粒梯度稀释液建立了RTi-PCR标准曲线。两种RTi-PCR检测体系对DNA重组质粒靶片段的检测灵敏度均可达1.2 fg/μL,比常规PCR的灵敏度高出两个数量级,可以准确地定量检测土壤中的R. solanacearum,实现了田间病害的早期诊断。④对来自田间的土壤样品进行了实际检测,证明了所建立的PCR检测体系是稳定可靠的。分别采用两种PCR检测体系对来自重庆彭水、黔江、酉阳等地35个田间土壤样品进行实际检测,结果与田间发病情况基本一致,证明所建立的PCR检测体系是稳定可靠的。⑤初步研制了快速检测试剂盒。采用核酸、酶的稳定剂结合真空冷冻干燥技术初步制备出R. solanacearum的分子检测试剂盒,可常温保存和储运,即开即用、操作简便,有利于实现R. solanacearum的快速检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 病害发生分布与危害
• 1.3 病原菌生物学特性
• 1.3.1 R.solanacearum 的分类地位
• 1.3.2 R.solanacearum 的形态及存活条件
• 1.3.3 R.solanacearum 的寄主范围
• 1.3.4 R.solanacearum 的侵染途径
• 1.4 R.SOLANACEARUM 检测研究现状
• 1.4.1 常规检测法
• 1.4.2 指示植物法
• 1.4.3 血清学方法
• 1.4.4 分子生物学方法
• 1.5 荧光定量PCR 技术在土壤微生物检测中的应用
• 1.5.1 提取和纯化土壤微生物总DNA 的研究进展
• 1.5.2 荧光定量PCR 技术在土壤病原微生物检测中的应用
• 1.6 研究目标与内容
• 1.6.1 研究目标
• 1.6.2 主要研究内容
• 1.7 技术路线
• 1.8 创新点
• 2 烟草青枯病菌常规PCR 检测体系的建立
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 主要培养基
• 2.1.3 细菌基因组DNA 提取试剂
• 2.1.4 其他主要试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细菌基因组DNA 的制备（CTAB 法）
• 2.2.2 烟草青枯病菌常规PCR 检测体系的建立
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 引物的筛选
• 2.3.2 常规PCR 检测体系的建立和优化
• 2.3.3 常规PCR 检测体系性能测定
• 3 土壤中烟草青枯病菌常规PCR 检测体系的建立
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 供试土壤样品
• 3.1.2 土壤基因组DNA 提取试剂
• 3.1.3 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 土壤样品的采集
• 3.2.2 土壤基因组总DNA 的制备
• 3.2.3 土壤中烟草青枯病菌常规PCR 体系的优化建立
• 3.2.4 PCR 扩增产物克隆、转化和鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 土壤样品的采集
• 3.3.2 土壤基因组总DNA 制备方法的比较
• 3.3.3 土壤中烟草青枯病菌常规PCR 体系的优化建立
• 3.3.4 PCR 产物扩增条带正确性的验证
• 4 土壤中烟草青枯病菌荧光定量PCR 检测体系的建立
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 供试菌株
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 烟草青枯病植株根际微生物的分离筛选
• 4.2.2 SYBR GreenⅠ荧光染料RTi-PCR 检测体系的建立
• 4.2.3 TaqMan 探针RTi-PCR 检测体系的建立
• 4.2.4 两种RTi-PCR 检测体系的比较与评价
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 烟草青枯病植株根际微生物的分离筛选
• 4.3.2 SYBR GreenⅠ荧光染料RTi-PCR 检测体系的建立
• 4.3.3 TaqMan 探针RTi-PCR 检测体系的建立
• 4.3.4 两种RTi-PCR 检测体系的比较与评价
• 5 烟草青枯病菌检测试剂盒的初步研制
• 5.1 材料与仪器
• 5.1.1 主要试剂
• 5.1.2 实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 标准阳性对照品的制备
• 5.2.2 烟草青枯病菌常规PCR 检测试剂盒的制备和性能测试
• 5.2.3 烟草青枯病菌RTi-PCR 检测试剂盒的制备和性能测试
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 烟草青枯病菌常规PCR 检测试剂盒的制备和性能测试
• 5.3.2 烟草青枯病菌RTi-PCR 检测试剂盒的制备和性能测试
• 6 讨论
• 6.1 引物和探针的设计及其检测特异性
• 6.2 RTI-PCR 中扩增片段长度对检测效果的影响
• 6.3 不同土壤基因组DNA 提取方法对检测结果的影响
• 6.4 常规PCR 和RTI-PCR 检测性能对检测结果的影响
• 6.5 两种RTI-PCR 检测体系的比较与评价
• 6.6 PCR 检测假阳性与假阴性的排除与降低
• 6.7 烟草青枯病菌分子检测试剂盒的评价
• 7 主要结论与后续工作展望
• 7.1 主要结论
• 7.2 后续工作展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A 烟草青枯病田间危害图
• B PCR 扩增片段测序结果及比对图
• C 攻读硕士学位期间参与的科研项目
• D 攻读硕士学位期间发表的论文目录
• E 攻读硕士学位期间撰写的专利