甘蔗与黑穗病菌互作的分子应答研究

论文摘要

由黑粉菌（Ustilago scitaminea Syd.）引起的甘蔗黑穗病是一种世界性病害,也是我国甘蔗生产的最主要真菌性病害,造成甘蔗感病品种蔗茎产量和蔗糖分的严重损失,并曾先后淘汰了一些丰产高糖的当家品种。解析甘蔗与黑穗病菌互作的分子应答,开拓分子育种途径就显得非常重要。本研究在综合应用RAPD、SRAP和ITS三种标记技术系统分析我国甘蔗黑穗病菌分子分化基础上,利用cDNA芯片、2-DE技术、MALDI-TOF-TOF/MS以及定量PCR等技术研究了甘蔗与黑穗病菌互作后的分子应答。结果表明,甘蔗黑穗病菌的分子分化同其地理来源相关,具有地域性特点,但与寄主品种无关,不存在共分化机制。研究结果还显示,ITS序列不适合于甘蔗黑穗病菌的系统发育分析。基于芯片杂交和蛋白组学研究,获得了36个上调表达基因和20个差异表达蛋白。这些上调表达的基因其功能涉及光合作用、离子转运和核酸代谢等多个途径,与转录因子、蛋白合成与修饰及信号转导相关的基因也上调表达,另有1个NBS类抗病基因;而差异表达蛋白分别参与蛋白质合成、信号转导、光合作用,另有1个为促进植保素合成的细胞色素C过氧化物酶、1个NBS类抗病蛋白和3个未知蛋白。根据拟南芥RPS2基因、烟草N基因和亚麻L6基因的保守结构域,设计简并引物,采用RT-PCR技术从甘蔗基因组DNA和cDNA中,克隆了11条NBS类抗病基因类似物。对编号为EF155648的NBS序列采用RACE技术,获得了一条2985 bp全长cDNA序列（Accession number:EF155654）,记作SNLR,该基因包括一个2661 bp的完整开放读码框（ORF）和一个29 bp的poly-A,属于non-TIR-NBS-LRR类抗病相关基因。定量PCR分析表明,SNLR基因可能与黑穗病抗性有关。此外,本研究还利用RAPD和BSA相结合的方法,筛选了能够应用于甘蔗黑穗病抗性评价的分子标记并成功转化为SCAR标记SC619,该标记具有应用于育种辅助选择的潜力。综上所述,甘蔗与黑穗病菌互作的分子应答在转录水平和翻译水平同时发生,甘蔗对黑穗病菌的抗性是众多基因和各种功能蛋白共同参与的一个分子适应过程,研究结果为深入解析甘蔗抗黑穗病分子机制提供了试验依据。而SNLR基因的克隆和SC619标记的开发为转基因育种和标记辅助选择提供了技术储备。另外,病原菌分子分化研究可以为抗病性鉴定中病原菌的选择和品种区域布局提供依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 植物与病原真菌互作的研究进展
• 1.1 植物与病原真菌互作的形态和细胞学基础
• 1.2 植物与病原真菌互作的生理代谢基础
• 1.3 植物与病原真菌互作的分子基础
• 2 甘蔗黑穗病菌小种分化与甘蔗抗黑穗病机制研究进展
• 2.1 甘蔗黑穗病菌小种分化研究进展
• 2.2 甘蔗对黑穗病的形态和细胞学抗性
• 2.3 甘蔗对黑穗病的生理生化抗性
• 2.4 甘蔗对黑穗病的分子水平抗性
• 3 本研究的目的、意义与研究内容
• 3.1 目的及意义
• 3.2 研究内容
• 第一章 甘蔗黑穗病菌（Ustilago scitaminea Syd.）的分子多样性研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 分离物来源
• 2.2 DNA的提取
• 2.3 甘蔗黑粉菌鉴定
• 2.4 RAPD分析
• 2.5 SRAP分析
• 2.6 ITS-PCR分析
• 2.7 数据处理
• 2.7.1 RAPD和SRAP的数据分析
• 2.7.2 序列分析
• 3 结果和分析
• 3.1 黑粉菌鉴定
• 3.1.1 DNA提取效果检测
• 3.1.2 黑粉菌鉴定
• 3.2 RAPD分析
• 3.2.1 RAPD扩增图谱分析
• 3.2.2 供试分离物的RAPD相异性
• 3.2.3 供试分离物的RAPD亲缘关系
• 3.3 SRAP分析
• 3.3.1 SRAP图谱分析
• 3.3.2 供试分离物的SRAP相异性
• 3.3.3 供试分离物的SRAP亲缘关系
• 3.4 RAPD和SRAP综合分析
• 3.5 ITS分析
• 4 讨论和结论
• 4.1 甘蔗黑穗病菌的分子分化同其地理来源和寄主品种间的关系
• 4.1.1 甘蔗黑穗病菌的分子分化同其地理来源的关系
• 4.1.2 甘蔗黑穗病菌的分子分化同其寄主品种的关系
• 4.2 ITS序列分析在甘蔗黑穗病菌小种分化研究中的应用
• 4.3 甘蔗黑穗病菌的小种分化
• 5 研究展望
• 第二章 甘蔗与黑穗病菌互作的基因差异表达研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 生化试剂
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 病原菌接种方法
• 2.2.2 cDNA芯片杂交
• 2.2.2.1 总RNA的提取和纯化
• 2.2.2.2 RNA线性放大
• 2.2.2.3 荧光探针的制备
• 2.2.2.4 荧光探针的纯化
• 2.2.2.5 荧光探针的定量
• 2.2.2.6 芯片杂交
• 2.2.2.7 芯片洗涤
• 2.2.2.8 cDNA芯片杂交的数据分析
• 2.2.3 cDNA克隆测序及序列分析
• 2.2.4 实时荧光定量PCR验证芯片杂交数据
• 3 结果与分析
• 3.1 cDNA芯片杂交效果
• 3.2 甘蔗与黑穗病菌互作后上调表达EST的筛选与功能分类
• 3.3 cDNA芯片杂交结果的定量PCR验证
• 4 讨论与结论
• 4.1 斑茅旱胁迫cDNA芯片用于研究甘蔗与黑穗病菌互作基因差异表达的可行性
• 4.2 甘蔗与黑穗病菌互作差异表达基因的功能及其作用模式
• 4.2.1 蛋白质合成与修饰相关基因及其功能
• 4.2.2 碳水化合物代谢相关基因及其功能
• 4.2.3 细胞信号转导相关基因及其功能
• 4.2.4 转录相关基因及其功能
• 4.2.5 核酸代谢相关基因及其功能
• 4.2.6 离子转运相关基因及其功能
• 4.2.7 甘蔗与黑穗病菌互作中起其它作用的基因及其功能
• 5 基因组学与蛋白组学的综合应用
• 第三章 甘蔗与黑穗病菌互作的差异蛋白分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 病原菌接种
• 2.2.2 叶片全蛋白提取
• 2.2.3 蛋白裂解和含量测定
• 2.2.4 第一向等电聚焦
• 2.2.5 第二向SDS-PEGE
• 2.2.6 差异蛋白的胶内酶解
• 2.2.7 质谱分析与数据库检索
• 3 结果与分析
• 3.1 黑穗病菌胁迫下甘蔗叶片蛋白质双向电泳图谱分析
• 3.2 差异表达蛋白质点的MALDI-TOF-TOF/MS分析
• 4 讨论和结论
• 5 研究展望
• 第四章 甘蔗抗病基因类似物的分离
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 供试菌株和质粒
• 2.1.3 引物序列
• 2.1.4 主要分子生物学及生化试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 RNA提取
• 2.2.2 cDNA合成
• 2.2.3 DNA提取方法
• 2.2.4 PCR反应体系与程序
• 2.2.5 目的片段的克隆
• 2.2.5.1 目的片段的回收
• 2.2.5.2 目的片段的连接和转化
• 2.2.5.3 感受态细胞的制备
• 2.2.6 阳性克隆鉴定
• 2.2.6.1 PCR鉴定
• 2.2.6.2 酶切鉴定
• 2.2.7 甘蔗抗病基因类似物多样性及进化关系分析方法
• 2.2.8 PIC基因功能的定量PCR分析
• 2.2.8.1 材料培养及处理
• 2.2.8.2 总RNA的提取
• 2.2.8.3 定量PCR分析
• 3 结果与分析
• 3.1 甘蔗NBS类RGA的分离与鉴定
• 3.2 甘蔗RGA编码氨基酸序列的比对及聚类分析
• 3.3 甘蔗PIC基因的表达分析
• 3.3.1 PIC基因和25S rRNA基因的定量PCR分析效果
• 3.3.2 PIC基因在不同处理条件下的表达分析
• 3.3.3 PIC基因在甘蔗根、茎和叶片中的表达情况
• 4 讨论与结论
• 5 研究展望
• 第五章 甘蔗抗病相关基因SNLR的克隆与表达分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料和处理
• 2.2 试剂、载体及菌株
• 2.3 研究方法
• 2.3.1 SNLR基因3'和5'端的克隆
• 2.3.1.1 RACE引物
• 2.3.1.2 3'RACE扩增
• 2.3.1.3 5'RACE扩增
• 2.3.1.4 目的片段的克隆与鉴定
• 2.3.2 SNLR基因的表达特点分析
• 2.3.2.1 总RNA的提取
• 2.3.2.2 定量PCR分析
• 3 结果与分析
• 3.1 甘蔗SNLR基因cDNA全长克隆及序列分析
• 3.2 甘蔗SNLR基因编码蛋白质氨基酸的结构分析
• 3.2.1 甘蔗SNLR基因所编码的蛋白质氨基酸保守结构分析
• 3.2.2 甘蔗SNLR基因所编码的蛋白质产物的疏水性分析
• 3.2.3 甘蔗SNLR基因所编码的蛋白产物的二级结构分析
• 3.3 甘蔗SNLR基因的系统进化分析
• 3.4 甘蔗SNLR基因的表达特性
• 3.4.1 SNLR基因和25S rRNA基因的PCR分析效果
• 3.4.2 不同外源胁迫因素对甘蔗SNLR基因表达的影响
• 3.4.3 SNLR基因在甘蔗根、茎和叶片中的表达情况
• 4 讨论与结论
• 5 研究展望
• 第六章 甘蔗黑穗病抗性评价分子标记的筛选与转化
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 甘蔗抗黑穗病鉴定方法
• 2.2.2 甘蔗DNA提取、抗感池制备和引物筛选
• 2.2.3 RAPD反应体系与程序
• 2.2.4 多态性DNA片段克隆与测序
• 2.2.5 SCAR标记的转化与验证
• 2.2.6 SCAR标记的应用
• 3 结果与分析
• 3.1 甘蔗黑穗病抗性评价分子标记的筛选
• 3.2 甘蔗黑穗病抗性评价分子标记的克隆与测序
• 3.3 SCAR标记的转化与验证
• 3.4 SCAR标记的应用
• 4 讨论和结论
• 第七章 结论与创新点
• 1 结论
• 2 创新点
• 参考文献
• 附录I 缩略词表
• 附录Ⅱ NBS类抗病基因类似物的氨基酸序列
• 附录Ⅲ SNLR基因全长序列
• 导师简历
• 个人简介
• 致谢