斑节对虾C1qBP及MP1的cDNA克隆与表达分析

论文摘要

斑节对虾（Penaeus monodon）是我国海水养殖的重要经济品种。近年来,斑节对虾亲虾养殖突破了不能人工调控成熟的瓶颈,获得以生态调控和营养调控为基础的全人工亲虾培育技术的巨大进展,但养殖过程中的病害威胁和虾体抗病力差依然是造成斑节对虾养殖产量偏低的重要原因。为此迫切需要从斑节对虾免疫系统入手,发掘和分析免疫相关的基因,研究其免疫调控规律,探讨其抗病机理,为进一步筛选抗病基因,从基因水平进行品种改良,提高虾体抗病能力奠定基础。为了研究宿主与病原微生物的相互作用,在所获得溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）感染斑节对虾的前后的转录组差异表达数据库中,经NCBI数据库比对分析发现补体系统重要配体分子补体1q结合蛋白（complement component 1 q subcomponent-binding protein,C1qBP）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）信号通路配体分子MAPK激酶1相互作用蛋白（ MAPK kinase 1 interacting protein 1,MP1）两个表达序列标签（Expression Sequence Tag, EST）。C1qBP是一个能结合多种配基、分布广泛的多功能蛋白,调控机体对炎症和微生物感染的免疫反应。利用RACE技术获得斑节对虾C1q结合蛋白（以下简称PmC1qBP）全长cDNA为1303 bp,包括789 bp的开放阅读框（ORF）,104bp的5’UTR和410bp的3’UTR（GenBank ID: HQ 412588）。预测PmC1qBP蛋白编码262个氨基酸,分子量大小为29.07KDa,理论等电点为4.74,生物信息学分析表明,PmC1qBP氨基酸序列含有2个潜在的糖基化位点Asn31和Asn127。其中78 aa-259 aa是一个保守的MAM33 superfamily结构域,是与C1q的球状头部结合的部位,69 aa-71 aa为一个RGD序列,是细胞粘合素结合的位点。利用MatGAT软件进行同源性和相似性分析,结果表明PmC1qBP与其它物种C1qBP序列具一定程度的保守性,同源性为（25.2%-71.9%）,相似性为（46.6%-82.4%）。进化树分析表明,PmC1qBP与淡水螯虾聚为一支,与埃及伊蚊等无脊椎动物有比较近的亲源关系。利用半定量和实时定量PCR（Real-time PCR）进行组织表达模式分析,结果表明PmC1qB mRNA在淋巴、肝胰腺、肠、血细胞、鳃、性腺、胃、神经中都有表达,并且在雌雄斑节对虾中的肠、胃、性腺、血细胞中的表达量分别存在着显著差异。PmC1qBP基因在不同发育阶段的表达特征结果表明, PmC1qBP基因在幼体时表达量低,随着发育阶段的推进,表达量逐渐上升,最后趋于稳定。利用实时定量PCR（Real-time PCR）检测了斑节对虾肝胰腺组织对脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）和溶藻弧菌免疫应激表达谱,结果显示LPS和溶藻弧菌显著诱导PmC1qBP转录本表达上调,而PGN诱导效果不明显,溶藻弧菌刺激后3 h后表达略有降低,当达到6 h后,表达量达到最大值,刺激组和对照组有极显著差异,这与转录组差异表达结果一致,这些结果说明PmC1qBP可能参与了斑节对虾抗菌的天然免疫应答反应。将该基因克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌并成功诱导表达带His-tag的融合蛋白,进一步用Ni-NTA亲和层析柱将重组蛋白纯化,获得了高含量高纯度的目的蛋白,并免疫小鼠制备多克隆抗体。利用PmC1qBP多抗,确定了天然PmC1qBP是一种不溶性蛋白,并在肝胰腺、精巢、肠中均有表达,存在38kD的前体和29 kD的成熟肽两种形式。利用纯化后的融合蛋白进行C1q竞争性抑制实验,发现rC1qBP能竞争性结合鼠C1q,证实了其结合活性。MP1可结合MAPK/ERK激酶,调控、分化、迁移、细胞增殖和炎症反应,同时研究发现MP1参与小鼠早期胚胎和皮肤发育过程。斑节对虾的MP1（以下简称PmMP1）基因为910 bp,包含372 bp的ORF,29 bp的5’UTR和509 bp的3’UTR（GenBank? ID: HQ339913）。预测MP1蛋白包含123个氨基酸,分子量大小为13.6 KDa,理论等电点为6.3,BLAST同源性分析显示,MP1的氨基酸序列包含一个保守的MAPKK1-int结构域（12 aa- 108 aa）。同源性分析表明PmMP1蛋白与其他物种该蛋白具有较高的保守性,其中与丽蝇蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）和海胆（Strongylocentrotus purpuratus）同源性分别为48%和47.5%。进化树结果显示MP1与海洋无脊椎动物海胆的MP1进化距离最近。检测了PmMP1在斑节对虾性腺不同发育阶段的表达谱,结果显示该基因在斑节对虾发育早期表达量最高,随着性腺的发育成熟,其表达量有降低趋势,同时卵巢含量高于精巢,推测PmMP1是斑节对虾的早期发育过程的重要调控因子。LPS和PGN刺激表达谱表明,PmMP1表达量受LPS和PGN刺激后上调,推测PmMP1参与斑节对虾先天性免疫。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 第一节 斑节对虾简介
• 第二节 甲壳动物免疫
• 1.2 甲壳动物免疫机制
• 1.2.1 表层屏障免疫
• 1.2.2 细胞性防御
• 1.2.2.1 细胞的吞噬作用
• 1.2.2.2 结节作用
• 1.2.2.3 包囊作用
• 1.2.3 体液性免疫
• 1.2.3.1 免疫识别
• 1.2.3.2 凝集素
• 1.2.3.3 溶菌酶和溶血素
• 1.2.3.4 酚氧化酶及酚氧化酶原激活系统
• 1.2.3.5 抗菌肽和抗菌蛋白
• 第三节 补体系统
• 1.3.1 补体系统组成
• 1.3.2 补体系统的功能
• 1.3.3 补体系统的激活途径
• 1.3.4 补体受体研究进展
• 第四节 丝裂原活化蛋白激酶信号途径（MAPK）
• 1.4.1 MAPK 的组成
• 1.4.1.1 ERK 途径的上游蛋白及各激酶的激活机制
• 1.4.1.2 JNK/SAPK2 通路
• 1.4.1.3 p38MAPK 通路
• 1.4.2 MAPK 信号调控机理
• 1.4.3 MAPK 信号通路的功能
• 1.4.4 MAPK 信号通路的研究进展
• 1.4.5 对虾免疫基因相关研究成果
• 1.4.5.1 基因功能方面
• 1.4.5.2 转录组方面的研究
• 1.4.5.3 蛋白质组方面的研究
• 第五节 本研究的目的和意义
• 第二章 斑节对虾 C1qBP 基因克隆、表达分析及原核表达
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 实验所用主要仪器设备
• 2.1.3 试剂和培养基配制
• 2.1.4 化学试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 斑节对虾C1qBP 基因的克隆
• 2.2.1.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 2.2.1.2 菌落PCR 鉴定重组质粒
• 2.2.1.3 斑节对虾C1qBP 的生物信息学分析
• 2.2.2 斑节对虾C1qBP 表达分析
• 2.2.2.1 总RNA 抽提及cDNA 合成
• 2.2.2.2 半定量PCR
• 2.2.2.3 实时荧光定量PCR
• 2.2.2.4 统计学分析
• 2.2.3 PmC1qBP 基因的原核表达
• 2.2.3.1 PmC1qBP 载体的构建
• 2.2.3.1.1 PmC1qBP-ORF 片段的 PCR 扩增
• 2.2.3.1.2 PmC1qBP-ORF 片段的 PCR 产物纯化
• 2.2.3.1.3 PmC1qBP-ORF 片段PCR 产物纯化后的双酶切
• 2.2.3.1.4 PmC1qBP-ORF 片段双酶切产物的切胶回收
• 2.2.3.1.5 PET32a 质粒的提取
• 2.2.3.1.6 PET32a 质粒的双酶切
• 2.2.3.1.7 PET32a 质粒双酶切产物的切胶回收
• 2.2.3.1.8 PmC1qBP-ORF 片段和 PET32a 质粒双酶切产物的连接
• 2.2.3.1.9 E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 2.2.3.1.10 重组质粒的转化
• 2.2.3.1.11 菌落PCR 鉴定重组质粒和序列测定
• 2.2.3.2 重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE 鉴定
• 2.2.3.3 重组蛋白的Western bloting 检测
• 2+ -NTA 树脂纯化'>2.2.3.4 PmC1qBP 片段融合蛋白的Ni²⁺ -NTA 树脂纯化
• 2.2.3.5 PmC1qBP-PET32a 重组菌的扩大培养
• 2.2.3.6 PmC1qBP 包涵体的制备及复性
• 2+-NTA HisBind 树脂准备'>2.2.3.7 Ni²⁺-NTA HisBind 树脂准备
• 2.2.3.8 柱层析
• 2.2.3.9 PmC1qBP 纯化蛋白的Western Bloting
• 2.2.3.10 C19 补体结合实验
• 2.2.3.11 抗体制备的实验
• 2.2.3.12 组织蛋白的Westen Bloting
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 RNA 提取
• 2.3.2 PmC1qBP 基因的序列分析
• 2.3.3 PmC1qBP 基因的高级结构预测
• 2.3.4 PmC1qBP 与其他物种 C1qBP 同源性分析
• 2.3.5 PmC1qBP 基因的mRNA 表达谱
• 2.3.5.1 PmC1qBP 基因在雌雄个体不同组织中的半定量分析
• 2.3.5.2 PmC1qBP 在雌雄个体不同组织中的定量分析
• 2.3.6 PmC1qBP 的发育表达谱
• 2.3.7 PmC1qBP 对 LPS、PGN、弧菌应激表达谱
• 2.3.8 PmC1qBP 的原核表达
• 2.3.8.1 PmC1qBP-PET32a 重组载体的构建
• 2.3.8.2 融合蛋白的诱导表达
• 2.3.8.3 采用BCA 方法测定融合蛋白浓度
• 2.3.9 补体C1q 结合实验
• 2.3.10 rC1qBP 多克隆抗体制备
• 2.3.10.1 C1qBP 的抗体特异性检测和效价分析
• 2.3.11 组织蛋白的 Western-blot
• 2.4 讨论
• 第三章 斑节对虾MP1 全长cDNA 的克隆与表达分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验所用材料
• 3.1.2 免疫挑战实验
• 3.1.3 RNA 的提取和cDNA 的合成
• 3.1.4 MP1 基因全长CDNA 的扩增
• 3.1.5 序列分析
• 3.1.6 RT-PCR 和real-time PCR 分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 Pm MP1 生物信息学分析
• 3.2.2 MP1 基因的高级结构预测
• 3.2.3 序列比对和系统进化树构建
• 3.2.4 组织表达特征
• 3.2.5 在不同性腺发育阶段 MP1 的表达特征
• 3.2.6 LPS 和PGN 刺激后MP1 的表达特征
• 3.3 讨论
• 全文总结
• 1. 斑节对虾 C1qBP 基因特征和表达分析
• 2. 斑节对虾 MP1 基因特征和表达分析
• 参考文献
• 硕士期间发表论文及参加会议
• 致谢