药用真菌植酸酶基因、β-葡萄糖苷酶基因的克隆

论文摘要

本研究从芸芝、黑芝、紫芝、韩芝、甜芝、Ga8、赤芝、灰树花、猴头菌、短裙竹荪、红托等16种药用真菌中筛选植酸酶生产菌。 利用植酸酶基因、β-葡萄糖苷酶基因的保守序列设计一系列引物,然后对以上4个菌株进行了植酸酶基因片段克隆;同时对以上16种药用真菌进行β-葡萄糖苷酶基因片段的克隆,一是进行产酶菌的筛选,二是进行引物的筛选。 植酸酶的特异引物phyR1、phyF3组合能从芸芝中分离克隆同源性较高的植酸酶基因片段,再在分离到的已知序列的5’端和3’端设计嵌套的特异引物phySP1、phySP2、phySP3和phySP1’、phySP2’、phySP3’,利用TAIL-PCR技术进行分离已知序列的侧翼序列,结合Blastn、ORF和primer5.0软件,再在侧翼序列上设计特异引物phyP3、phyP4,最终从芸芝中分离克隆到全长的植酸酶基因。 根据已知的β-glucosidase基因的保守序列设计特异引物组合bgsR1、bgsF3能从猴头菇的菌丝体中克隆到同源性较高的β-glucosidase基因片段H1,再利用TAIL-PCR技术扩增H1两端的侧翼序列H2和H3,H2和H3序列经Blastn、ORF和primer5.0软件分析后,再设计H2和H3侧翼序列的特异引物对猴头菇的基因组DNA进行扩增,最终扩增到全长的β-glucosidase基因H4。 筛选结果是芸芝、甜芝、赤芝、灰树花、短裙竹荪、红托、茯苓、紫芝8个品种能产生透明圈,其余菌株不能产生。对透明圈与菌落直径比较大的芸芝、红托、灰树花、赤芝四种菌株进行植酸酶酶活测定,测定结果表明芸芝产酶能力最强,红托虽然比值较大,但酶活最低。 结合TAIL-PCR扩增的序列和Gene-bank中登录的序列并分析,设计Phytase和β-Glucosidase基因的RT-PCR引物,利用RT-PCR技术对这两个基因进行克隆。利用TAIL-PCR技术和RT-PCR技术扩增到的植酸酶基因序列长1612bp和1312bp,β-葡萄糖苷酶基因序列长2226bp和1920bp。利用DNAman软件对用TAIL-PCR技术和RT-PCR技术扩增到的这两个基因序列进行比较分析,植酸酶基因含有6个内含子,β-葡萄糖苷酶基因含有3个内含子。通过Vector NTI7软件分析,这两个基因都含有其实密码子ATG和终止密码子TAG,并具有完整的阅读框架,说明我们克隆到的基因是全序列。通过Blastn、Blastx分析,它们与Genebank中登录的序列的同源性达到了90%,但又没有完全相同的序列,说明我们克隆到的基因是新的植酸酶基因和β-葡萄糖苷酶基因。

论文目录

• 1 前言
• 1.1 植酸酶的研究
• 1.1.1 植酸及植酸酶
• 1.1.1.1 植酸的分布与营养特性
• 1.1.1.2 植酸酶的种类及来源
• 1.1.1.3 植酸酶活性
• 1.1.2 植酸酶研究的现状
• 1.1.3 植酸酶对动物生产性能的影响
• 1.1.4 存在问题
• 1.1.5 小结
• 1.2 β-葡萄糖苷酶概述
• 1.2.1 β-葡萄糖苷酶的分布
• 1.2.2 β-葡萄糖苷酶的酶学性质
• 1.2.3 β-葡萄糖昔酶的研究进展
• 1.2.4 β-葡萄糖昔酶的应用
• 1.3 一种DNA侧翼序列分离技术—TAIL-PCR
• 1.3.1 引物设计
• 1.3.2 TAIL-PCR的反应程序
• 1.3.3 反应条件（各成分组成）
• 1.3.4 优缺点
• 1.3.5 研究现状及应用前景
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.5 研究内容
• 1.6 技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 培养基成分与配制
• 2.2.2 植酸钙的制备
• 2.2.3 试剂的配制
• 2.2.4 菌丝的培养与收集
• 2.2.5 产植酸酶菌株的筛选及酶活测定
• 2.2.6 药用真菌菌丝总DNA的提取
• 2.2.7 药用真菌RNA的提取
• 2.2.8 TAIL-PCR的技术和方法
• 2.2.9 目的片段的回收及纯化
• 2.2.10 连接产物的转化
• 2.2.10.1 大肠杆菌（E. coli DH5α）的单菌落培养
• 2.2.10.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.10.3 转化
• 2.2.11 SDS碱裂解法制备质粒DNA
• 2.2.12 基因克隆
• 2.2.12.1 引物设计、合成
• 2.2.12.1.1 植酸酶的引物设计
• 2.2.12.1.2 β-Glucosidase的引物设计
• 2.2.12.1.3 RT-PCR引物设计
• 2.2.12.2 基因克隆
• 2.2.12.2.1 植酸酶基因克隆
• 2.2.12.2.2 β-Glucosidase基因的克隆
• 2.2.13 RT-PCR
• 2.2.13.1 反转录
• 2.2.13.2 RT-PCR
• 2.2.13.2.1 植酸酶基因
• 2.2.13.2.2 β-Glucosidase基因
• 3 结果与分析
• 3.1 产植酸酶菌株的筛选
• 3.1.1 透明圈筛选结果
• 3.1.2 液态发酵各菌株酶活力比较
• 3.2 药用真菌DNA的提取
• 3.3 目的片段的PCR扩增
• 3.4 植酸酶基因片段的克隆及同源性比较分析
• 3.5 芸芝植酸酶基因的克隆
• 3.5.1 植酸酶基因片段的克隆，鉴定及测序
• 3.5.2 植酸酶基因片段侧翼序列克隆，鉴定及测序
• 3.5.3 植酸酶基因的克隆，鉴定及测序
• 3.6 β-Glucosidase基因的克隆
• 3.6.1 猴头菌DNA的提取
• 3.6.2 目的基因的克隆，鉴定及测序
• 3.6.2.1 β-Glucosidase基因片段的克隆，鉴定及测序
• 3.6.2.2 β-Glucosidase基因片段侧翼序列克隆，鉴定及测序
• 3.6.2.3 β-Glucosidase基因的克隆，鉴定及测序
• 3.7 RNA提取
• 3.8 RT-PCR基因克隆
• 3.8.1 植酸酶基因克隆
• 3.8.2 β-Glucosidase基因克隆
• 4 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 致谢