犬IFN-γ及IL-2的原核表达和IL-2生物活性检测

论文摘要

根据GenBank 上发表的犬（canine familiars）干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）和白细胞介素-2 （Interteukin-2,IL-2 ）基因序列,设计了两对引物。采用RT-PCR 技术以ConA刺激的犬脾淋巴细胞为材料,从总RNA 中扩增出犬IFN-γ和IL-2 基因。分离纯化扩增片段,克隆入pMD18-T 载体,经酶切鉴定、PCR 鉴定及DNA 测序分析,表明扩增片段为犬IFN-γ和IL-2 基因。测序结果显示克隆的IFN-γ基因全长426 个核苷酸,编码141 个氨基酸,与GenBank 中CaIFN-γ比较,核苷酸序列同源性为99.8%,推导的氨基酸序列同源性为99.3%;克隆的IL-2 基因全长468 个核苷酸,编码155 个氨基酸,将该序列与GenBank中D30710 CaIL-2 比较,核苷酸序列同源性为99.36%,推导的氨基酸序列同源性为98.7%。应用DNA 重组技术,将犬IFN-γ和IL-2 基因分别插入到原核表达载体PJLA605 中,构建原核表达质粒PJLA605-CaIFN-γ和PJLA605-CaIL-2,转化大肠杆菌DH5α,并通过改变诱导时机和诱导表达时间来优化表达条件。结果表明,工程菌PJLA605-CaIFN-γ和PJLA605-CaIL-2 在30℃培养至对数生长后期（OD600 为1.5）转温诱导4h,菌体湿重收得量分别达18.0g/L 和17.8g/L,目标蛋白表达量分别占菌体总蛋白的27.4%和29.4%,这两种基因工程菌得到了理想表达。SDS-PAGE 电泳显示,NaCl 和TritonX-100 可洗去部分杂蛋白,表达产物以包涵体形式存在。尿素溶解包涵体并通过Sephacry1S-200 分子筛初步纯化,包涵体的纯度均达到90%以上。复性后的IL-2 蛋白用MTT 法检测生物活性,结果显示稀释复性的IL-2 蛋白淋巴细胞增殖系数可达2.01,表明此种蛋白具有IL-2 的生物活性。

论文目录

摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 IL-2 的研究进展

1.1.1 IL-2 的发现及命名

1.1.2 IL-2 的结构与产生

1.1.3 IL-2 受体的研究

1.1.4 IL-2 的理化特性和生物学活性

1.1.5 IL-2 的种属特异性

1.1.6 IL-2 活性的检测

1.1.7 IL-2 的应用

1.2 干扰素的研究进展

1.2.1 干扰素的发现

1.2.2 干扰素的性质和分类

1.2.3 干扰素的产生与诱导

1.2.4 IFN 的基因结构

1.2.5 IFN-γ的分子结构与生物学作用

1.2.6 IFN 抑制病毒复制的作用机理

1.2.7 IFN 的应用和发展趋势

1.3 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种与质粒

2.1.2 引物

2.1.3 试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 犬脾淋巴细胞的制备

2.2.2 细胞总RNA 的提取

2.2.3 cDNA 的合成

2.2.4 IL-2 和IFN-γ基因片段的克隆与序列分析

2.2.5 IL-2 与IFN-γ基因原核表达载体的构建

2.2.6 目的基因在大肠杆菌中的高效表达及纯化

2.2.7 蛋白的复性及生物活性检测

3 结果

3.1 重组质粒的双酶切及PCR 鉴定

3.1.1 CaIFN-γ-T 及PJLA605-CaIFN-γ重组质粒鉴定

3.1.2 CaIL-2-T 及PJLA605-CaIL-2 重组质粒鉴定

3.2 重组质粒克隆基因的序列分析

3.2.1 重组质粒IFN-γ基因的序列分析

3.2.2 重组质粒IL-2 基因的序列分析

3.2.3 各种动物IL-2 及IFN-γ基因的同源性比较

3.3 重组蛋白的表达及最佳表达时机的确立

3.4 工程菌的高效表达

3.4.1 IFN-γ工程菌的高效表达

3.4.2 IL-2 工程菌的高效表达

3.5 包涵体的提取及目的蛋白的纯化

3.5.1 包涵体的提取

3.5.2 目的蛋白的纯化

3.5.3 复性的IL-2 蛋白生物活性检测

4 讨论

4.1 犬IFN-γ和IL-2 基因的扩增和序列分析

4.2 目的基因在原核细胞中的理想表达

4.3 表达产物的处理及生物活性的检测

5 结论

致谢

参考文献

附录1 实验技术路线

附录2 犬IFN-γ和IL-2 基因克隆及表达载体构建图

附录3 各种动物IL-2 及IFN-γ基因的同源性比较

攻读硕士学位期间发表的学术论文

相关论文文献

[1].合作猪IFN-ε基因克隆及生物信息学分析[J]. 西北农业学报 2020(01)
[2].IFN-γ基因多态性与脊柱结核易感性及血清IL-4和IFN-γ的关系[J]. 中华医院感染学杂志 2020(04)
[3].基因芯片技术检测分枝杆菌和IFN-γ测定对结核性胸膜炎的诊断价值[J]. 临床肺科杂志 2020(04)
[4].支气管哮喘患儿血清IL-4、HIF-1α、IFN-γ、VEGF水平的检测及其临床意义[J]. 临床医学研究与实践 2020(16)
[5].阿帕替尼联合针对性护理对转移性胃癌患者安全性及VEGF、IFN-γ的影响[J]. 现代医学与健康研究电子杂志 2020(07)
[6].IFN-γ及其基因多态性与急性一氧化碳中毒后迟发性脑病的关联性研究[J]. 南昌大学学报(医学版) 2020(03)
[7].太极拳运动对慢性荨麻疹患者外周血IFN-γ和IL-4水平的影响[J]. 中国皮肤性病学杂志 2016(10)
[8].血管活性肠肽对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑组织IFN-γ、IL-4因子含量的影响[J]. 东南大学学报(医学版) 2017(01)
[9].感染豆状囊尾蚴家兔血清中IL-10与IFN-γ水平检测研究[J]. 中兽医医药杂志 2017(01)
[10].重组大熊猫IFN-γ聚氰基丙烯酸正丁酯纳米球的制备与评价[J]. 动物学杂志 2017(02)
[11].玉屏风颗粒对复发性生殖器疱疹患者血清IFN-γ、IL-4水平的影响研究[J]. 中国性科学 2017(04)
[12].激素吸入对支气管哮喘儿童外周血单个核细胞IL-2、IFN-γ的影响[J]. 中国医药指南 2017(11)
[13].香蓝驱毒颗粒治疗扁平疣临床疗效及对IL-10、IFN-γ的影响[J]. 中国中西医结合皮肤性病学杂志 2017(03)
[14].腹腔镜下根治性膀胱切除术治疗膀胱癌的疗效及对患者血清IL-6及IFN-γ水平的影响[J]. 现代生物医学进展 2017(21)
[15].匹多莫德在小儿慢性扁桃体炎中的临床疗效及对血清IL-4和IFN-γ的影响[J]. 中国医药科学 2017(16)
[16].肺炎支原体肺炎患儿血清IL-6、IFN-γ的变化及意义[J]. 中国现代药物应用 2016(02)
[17].盐酸非索非那定片联合丙酸氟替卡松治疗变应性鼻炎疗效及对患者IFN-γ、IL-4的影响[J]. 中外医疗 2016(07)
[18].百合固金汤合生脉散对肺结核患者血清中IFN-γ含量的影响[J]. 河南中医 2016(05)
[19].白芍总苷对糜烂型口腔扁平苔藓患者外周血中IFN-γ及IL-10表达的影响研究[J]. 口腔医学研究 2016(05)
[20].复方茯苓汤不同组方配伍对变应性接触性皮炎模型小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-10水平的影响[J]. 北方药学 2015(02)
[21].抗支口服液对哮喘大鼠IFN-γ与IL-6含量的影响[J]. 中医药信息 2015(05)
[22].联合应用伊马替尼和IFN-α治疗慢性髓性白血病的临床效果观察[J]. 临床和实验医学杂志 2013(21)
[23].血清胱抑素C、IFN-γ水平在血管性痴呆患者中的变化及临床意义[J]. 中风与神经疾病杂志 2019(12)
[24].肝素联合阿司匹林对不明原因的复发性流产患者激素水平及血清IL-4、IFN-γ水平的影响[J]. 现代医学与健康研究电子杂志 2020(13)
[25].IFN-γ预处理骨髓间充质干细胞及其抑制小胶质细胞活化作用的影响[J]. 武警医学 2017(06)
[26].翁苋颗粒对鸡白痢IL-2和IFN-γ的影响[J]. 中国兽医杂志 2017(05)
[27].种植体周围炎龈沟液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6的表达及临床意义[J]. 医学研究杂志 2015(12)
[28].复方苦参注射液联合IFN-α、IL-2治疗转移性肾癌69例临床观察[J]. 临床医药文献电子杂志 2014(11)
[29].西酞普兰在慢丙肝患者中IFN-α诱发精神症状中的作用分析[J]. 医药论坛杂志 2015(02)
[30].清热化瘀汤对过敏性紫癜患者IL-4及IFN-γ水平的影响[J]. 新中医 2015(08)

标签：克隆论文; 原核表达论文; 活性检测论文;

犬IFN-γ及IL-2的原核表达和IL-2生物活性检测

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢