纳米磁珠与PCR联合技术在玉米病原菌快速检测中的应用研究

论文摘要

植物病原细菌是一类危害性极大的病原生物,可引起广泛传播,造成巨大经济损失。玉米细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii subsp. stewartii, pstew）和玉米内州萎蔫病菌（Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis, cmn）能引起玉米作物的毁灭性的病害,其中pstew在美国,加拿大,墨西哥、越南、泰国等国家均有报道,cmn因首次爆发于美国内州而得名,我国目前尚未见病原菌爆发的报道。二者的传播方式主要有种媒和虫媒两种传播途径,而且我国每年都要从国外进口大量的玉米种子,因此对玉米种子进行有效快捷的病原菌检疫尤为重要。植物病原细菌的口岸检疫要求简单、快捷、准确,技术要求比较高,其检测手段一直是口岸植物检疫的难点。因此,有效控制细菌病害的入侵主要是提高口岸病原菌的检测技术水平,研究出一种简便快速且高灵敏度的检测方法十分重要。采用化学共沉淀等方法合成了纳米裸磁珠和表面修饰的纳米磁珠,并通过TEM和DLS测试对合成磁珠进行表征分析。采用PCR 16S rDNA扩增和测序对玉米细菌性枯萎病菌和玉米内州萎蔫病菌进行初步鉴定。将磁珠和菌液共同孵育,通过磁珠与菌液非特异性结合的方式,选择吸附性能最佳的磁珠,优化孵育反应的条件,比如孵育温度,时间,磁珠用量等,确定最佳孵育条件。在最佳条件下,磁珠和菌液孵育,进行菌体结合和浓缩,磁场分离后,利用特异性引物,通过PCR方法,对目标菌特异性检测。本文还使用扫描电镜对两种病原菌的形态学进行了观察。通过透明圈抑菌实验检测磁珠对目标菌的毒性作用。通过DLS测得的Zeta电位表明,合成的纳米磁珠表面带有不同的电荷,其中表面修饰PDDA的带有正电荷,共沉淀法合成的裸磁珠,表面带有负电荷,表面修饰有PSS及-COOH,带有很强的负电荷。而且合成磁珠的粒径大小从20 nm到500 nm不等。PCR 16S rDNA扩增和测序比对证实,所用引物正确,能够实现菌株的特异性检测。将四种磁珠和菌液孵育后,初步分析磁珠和菌结合的原因,发现表面带正电荷的磁珠与菌有最大的结合。磁珠大小和形状等也对磁珠与菌的结合有一定的影响,但因本文采用磁珠的电荷差异较大,故无法分析磁珠粒径对磁珠与菌结合的影响。吸附率与磁珠的用量成正相关,在磁珠浓度为4 mg/mL的时候达到平衡。温度对吸附率的影响不大,室温下即可,这与目标菌的最适生长温度为24～28℃一致。孵育时间对吸附率的影响较大,其中玉米细菌性枯萎病菌与磁珠孵育40 min达到饱和,而玉米内州萎蔫病菌与磁珠孵育20 min后就能达到饱和,分析可能的原因为两种病原菌的细胞壁厚度,及菌的大小不一样造成的。磁珠与细菌结合后,通过磁场分离,能达到快速分离的效果并且对溶液中的细菌起到一个浓缩的作用。在最佳孵育条件下,两种检疫病原菌与纳米磁珠共同孵育,能达到菌体浓缩目的,PCR扩增能够实现简单快速的特异性检测。通过纳米磁珠的吸附浓缩和PCR组合鉴定,可以提高检测灵敏度,满足病原菌检疫的实际检测需要。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略语索引
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 玉米细菌性枯萎病菌与玉米内州萎蔫病菌研究进展
• 1.1 玉米细菌性枯萎病菌研究进展
• 1.2 玉米内州萎蔫病菌研究进展
• 2 纳米磁珠及合成
• 2.1 纳米磁珠
• 2.2 纳米磁珠的特性
• 2.3 纳米磁珠合成方法及表征
• 3 纳米磁珠在微生物检测中的应用
• 4 展望
• 5 研究内容及意义
• 第二章 菌种的鉴定
• 1 实验材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 pstew和cmn的PCR扩增结果
• 2.2 转化结果
• 2.3 测序结果及分析
• 2.4 电镜下形态观察照片
• 3 讨论
• 第三章 纳米磁珠的合成与表征测定
• 1 实验材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 TEM照片及粒径大小
• 2.2 磁珠的粒径及表面电荷等信息
• 3、小结
• 第四章 磁珠与实验菌的吸附试验及其抑菌性检测
• 1 试验材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 磁珠吸附细菌试验
• 2.2 磁珠抑菌试验结果
• 2.3 磁珠富集后PCR检测
• 3.讨论
• 第五章 结论与展望
• 1 主要结论
• 2 主要创新点
• 3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录1、pstew测序结果
• 附录2、cmn测序结果
• 附录3、pstew基因比对结果
• 附录4、cmn基因比对结果
• 附录5、各磁珠DLS测试结果