论文摘要
丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）是多种植物中常见的一种病原细菌,可引发宿主植物发生超敏反应（Hypersensitive response）或发生冻害病变,其中导致植物组织和细胞内的水分形成冰晶的致病分子——冰核蛋白（Ice nucleation protein, INP）,就是该菌在受到信号分子激发后所合成的一种诱导表达型分泌蛋白。因此,研究该蛋白基因的转录活性与调控因子,对于深入理解丁香假单胞菌冰核活性的发生与致病机制,以及发掘相应的植病生防机制将具有重要意义。丁香假单胞菌MB03是一株具有高冰核活性的菌株,其冰核基因inaQ已通过原位杂交的方法克隆（GenBank登录号：EU360731）。本研究以该冰核基因的启动子作为研究对象,以绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein, GFP）为报告蛋白,研究了在不同培养基、不同培养温度和不同外源化学诱导物作用下,该启动子分别在丁香假单胞菌、大肠杆菌（Escherichia coli）和恶臭假单胞菌（P. putida AB92019）中的转录与表达活性,从而确定了该启动子为一种低温依赖型启动子,且启动活性受3,5-二硝基水杨酸等外源诱导物显著性调控。冰核基因inaQ包含上游522 bp序列和完整的编码1200 aa的结构基因。通过生物信息学方法分析发现,inaQ启动子序列与3个已报道的冰核基因启动子有较高的相似性。对其启动子的特征区域进行预测,得到了与大肠杆菌启动子的-35区和-10区类似的保守序列,分别为TTGCTG （B box）和GGTTAAATT （Abox）。利用RT-qPCR对冰核基因inaQ转录活性进行相对定量分析,通过分别在16℃和28℃培养条件下其生长阶段的基因转录活性水平的比较,结果显示该启动子在16℃培养下冰核基因的转录水平明显高于丁香假单胞菌的正常培养温度28℃下的水平,在对数生长中后期前者是后者的将近两倍,而到稳定期中期则达到接近6倍,并且在16℃下有利于冰核基因的持续转录表达。利用SOE-PCR的方法将冰核基因上游522 bp启动子序列和绿色荧光蛋白（GFP）融合片段,插入到载体质粒pUCP18的PstⅠ/EcoR I位点,获得了重组载体PInaQ522GFP,用于在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中分析inaQ启动子活性。通过显微镜观察和SDS-PAGE的检验,在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中均可以表达GFP蛋白,并使细胞产生可见荧光,证明全长的启动子具有启动活性。通过删除全长启动子不同预测的活性区,得到2个长度分别为297 bp和111 bp的截短的启动子片段,并分别构建得到表达GFP的重组质粒,经过荧光活性检测,发现全长的启动子的重组菌和297bp截短启动子的重组菌的荧光强度分别为356.7和352.5,而含有111bp的截短启动子则未检测到荧光,证明启动子的2个活性区（A box和B box）直接决定了是否转录作用,而其远端序列长度则对对启动子活性影响不大。选择了1种在大肠杆菌和假单胞菌等革兰氏阴性菌中广泛存在的oprL基因的启动子为对照,比较了两者在常规培养条件下的启动活性,在大肠杆菌中含有冰核基因启动子的重组菌最大荧光强度为456.7,平均荧光强度值为330.1而含有oprL基因启动子的荧光强度分别为323.7和188.9,说明在大肠杆菌中冰核基因启动子明显优于oprL基因启动子,而在恶臭假单胞菌中,两者有相近活性分别为平均荧光强度分别为99.2和130.9,oprL启动子略优。选择不同的培养基,不同的温度和不同的外源化学诱导物对启动子进行诱导,探究该冰核基因启动子的表达条件。在培养基选择方面,采用KB培养基和NAD培养基培养时,比相同条件下LB培养荧光强度提高了32.5%和27.3%。在温度方面,16℃培养时,大肠杆菌和恶臭假单胞菌稳定期中期的荧光强度分别较28℃提高17.9%和30.1%,说明在相对较低温度下,该基因有相对较高的表达活性,起到了上调作用。在诱导物方面,不同诱导物对该启动子的活性具有上调和下调作用,其中具有上调作用的分别是硫酸钠、硝酸钠、3,5-二硝基水杨酸、对苯二酚、4-羟基-3硝基苯乙酸,其中3,5-二硝基水杨酸具有最大上调活性。研究亦证实芥菜籽的热水抽提物和4-羟基-3硝基苯乙酸具有类似的诱导活性,通过高效液相分析诱导物的化学组成,初步证实了4-羟基-3硝基苯乙酸是芥菜籽热水抽提物中的活性成分而诱导了该启动子的转录活性。