仿刺参体表微生物多样性研究

论文摘要

本论文从传统的培养法和分子生物学方法两个方面对大连仿刺参体表微生物的多样性进行了研究。将不同季节仿刺参体表可培养细菌进行分离,生理生化特性实验,16S rDNA序列比对分析。结果表明：从仿刺参体表分离得到的细菌主要有交替假单胞菌、希瓦氏菌、弧菌、假单胞菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌、Alteromonadaceas、不动杆菌、解淀粉芽孢杆菌和腐生葡萄球菌。其中交替假单胞菌和希瓦氏菌为仿刺参体表微生物的共生优势菌群,弧菌为仿刺参体表微生物的附生优势菌群。这三类细菌均属于γ-变形菌纲,其中交替假单胞菌和希瓦氏菌又同属于γ-变形菌纲中的交替单胞菌科。从秋季仿刺参和春季仿刺参体表分离的细菌数量高于冬季仿刺参,而秋季和春季是仿刺参的生长期,从仿刺参体表分离的细菌数量在其生长期明显高于其非生长期,表明仿刺参体表微生物数量与其生长状态有关。通过仿刺参体表细菌总DNA的提取,16S rDNA的PCR扩增,TA克隆,阳性克隆的筛选以及限制性片段长度多态性分析等分子生物学技术,对仿刺参体表未培养细菌多样性进行了初步分析。结果表明：利用试剂盒法提取的细菌总DNA的纯度较高；细菌总DNA的16S rDNA的PCR扩增条件为预变性94℃5 min,变性94℃1 min,退火50 ℃40 s,延伸72℃9 0 s,30个循环；随机挑取90个转化子获得了53个成功的TA克隆,用限制性内切酶Hae Ⅲ和Hinf Ⅰ将其PCR扩增产物进行双酶切,得到了11条不同的酶切条带,可以初步推断仿刺参体表至少含有11种不同的细菌菌群。且利用分子生物学技术分离的细菌除了可培养的细菌外,还存在一定种类的未培养的细菌。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 海参
• 1.1.1 海参形态与生物学特性
• 1.1.2 海参的营养与功效
• 1.1.3 海参的分布
• 1.2 仿刺参体表微生物的研究状况
• 1.2.1 海洋动物与体表微生物
• 1.2.2 仿刺参体表微生物组成的研究
• 1.2.3 仿刺参养殖与病害的发生
• 1.3 常见细菌的鉴定技术
• 1.3.1 表型鉴定法
• 1.3.1.1 细菌常规鉴定法
• 1.3.1.2 细菌的数值鉴定和自动化鉴定
• 1.3.1.3 化学分类鉴定法
• 1.3.2 分子遗传学鉴定法
• 1.3.2.1 细菌染色体DNA G+C含量测定
• 1.3.2.2 核酸杂交技术
• 1.3.2.3 质粒图谱分析法
• 1.3.2.4 限制性片段长度多态性分析
• 1.3.2.5 随机扩增DNA多态性分析
• 1.3.2.6 PCR技术
• 1.3.2.7 16S rRNA序列分析法
• 1.4 未培养微生物的研究
• 1.4.1 未培养微生物
• 1.4.2 从未培养微生物中获取新基因资源的研究
• 1.5 微生物的多样性研究
• 1.5.1 总DNA的提取和纯化
• 1.5.1.1 染色体DNA的提取
• 1.5.1.2 质粒DNA的提取方法
• 1.5.1.3 DNA的纯化
• 1.5.1.4 DNA的定量测定
• 1.5.2 应用序列分析和指纹图谱的方法评价微生物多样性
• 1.5.2.1 序列分析
• 1.5.2.2 指纹图谱
• 1.5.3 采用分子标记进行微生物群落结构分析
• 1.5.3.1 扩增片段长度多态性
• 1.5.3.2 限制性片段长度多态性
• 1.5.3.3 基于PCR技术的研究方法
• 1.5.3.4 采用分子探针来鉴定和分析微生物
• 1.6 论文研究内容及意义
• 第二章 仿刺参体表可培养细菌的分离鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 培养基及配制方法
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 样品的前处理
• 2.2.2 细菌的分离和培养
• 2.2.3 细菌的形态观察
• 2.2.4 细菌的生理生化特性分析
• 2.2.5 细菌的分子遗传学鉴定和系统发育分析
• 2.2.5.1 细菌基因组DNA的制备
• 2.2.5.2 16S rDNA的PCR扩增
• 2.2.5.3 测序和系统发育分析
• 2.2.5.4 酶切
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 不同培养基主要分离的细菌种类
• 2.3.2 不同季节仿刺参体表细菌数量的变化
• 2.3.3 仿刺参体表细菌的菌体形态
• 2.3.4 仿刺参体表细菌生理生化特性分析
• 2.3.5 养殖海水中细菌的鉴定
• 2.3.6 仿刺参体表可培养细菌的系统发育学分析
• 2.3.7 仿刺参体表可培养细菌的酶切图谱
• 2.3.8 仿刺参体表可培养细菌的菌相分析
• 2.4 小结
• 第三章 仿刺参体表未培养细菌多样性的初步分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 样品采集
• 3.1.2 菌株和质粒
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 工具酶
• 3.1.5 引物
• 3.1.6 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 仿刺参体表细菌总DNA的提取
• 3.2.2 样品16S rDNA的PCR扩增
• 3.2.2.1 PCR扩增
• 3.2.2.2 PCR产物回收纯化
• 3.2.3 构建16S rDNA克隆
• 2法制备大肠杆菌感受态细胞'>3.2.3.1 CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞
• 3.2.3.2 TA克隆
• 3.2.3.3 转化
• 3.2.4 TA克隆的筛选与验证
• 3.2.5 重组质粒DNA的提取和扩增
• 3.2.5.1 重组质粒DNA的提取
• 3.2.5.2 重组质粒DNA的PCR扩增
• 3.2.6 Hae Ⅲ和Hinf Ⅰ双酶切
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 不同DNA提取方法的裂解效率及纯化质量评价
• 3.3.2 细菌总DNA PCR扩增结果
• 3.3.2.1 影响PCR结果的因素
• 3.3.2.2 PCR扩增结果
• 3.3.3 克隆结果
• 3.3.3.1 TA克隆效率的影响因素
• 3.3.3.2 TA克隆结果
• 3.3.4 限制性片段长度多态性分析
• 3.4 小结
• 总结
• 问题与展望
• 参考文献
• 致谢