长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的原核、真核表达及其结构的预测

论文摘要

长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）是我国流行最广泛和最重要的蜱种之一,主要叮咬牛、羊以及多种脊椎动物,是病毒、立克次氏体、螺旋体、细菌、原虫、支原体、以及衣原体等多种病原重要的传播媒介,主要影响家畜的生产性能,为畜牧业的发展造成极为严重的危害。在众多蜱的防控方法中,免疫学防制是前景最诱人的方法之一。丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine proteinase inhibitor,serpin）是一类丝氨酸蛋白酶活性调节剂,参与血凝、纤维蛋白溶解、补体激活、炎症反应及肿瘤抑制过程。广泛存在于动物、植物、病毒和细菌等各种生物中。蜱中的serpin与血液凝固、细胞因子激活等相关的宿主防御反应有关,用蜱的丝氨酸蛋白酶及其抑制剂免疫宿主,能明显地削弱蜱传播病原的能力,而长角血蜱中的丝氨酸蛋白酶抑制剂存在于血淋巴中,研究证明是一种“隐藏抗原”,是抗蜱疫苗候选抗原分子。同时该基因具有抗纤维蛋白酶活性,可能与血淋巴内的血液凝固调节有关。本研究根据GenBank中长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂（Haemaphysalis longicornis serine proteinase inhibitor -2, HLS2）基因序列设计特异性引物,以长角血蜱饥饿[0]成蜱总RNA为模板,经RT-PCR扩增出1164 bp的HLS2 DNA片段。将其与pET-30a载体连接,构建pET-30a-HLS2表达载体,转化E. coli JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆,经双酶切鉴定及测序分析后转化到E. coli BL21（DE3）表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析。优化表达条件并大量表达后纯化融合蛋白,用Western blotting鉴定其抗原性。结果表明:获得的HLS2 DNA片段与GenBank中的HLS2 （序列号AB162827）序列的同源性为98%;构建的pET-30a-HLS2表达载体在大肠杆菌中表达了大小约为47KDa的HLS2融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在,IPTG终浓度为1.0 mmol/L、28℃诱导7h后融合蛋白的表达量最高;Western blotting显示该融合蛋白可与兔抗长角血蜱阳性血清反应。将前述扩增获得到长角血蜱HLS2基因,与酵母表达载体pPIC9k连接,构建真核表达载体pPIC9K-HLS2,用SalⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化毕赤酵母GS115,在MD平板上挑取重组克隆,经G418抗性筛选重组菌株,并用甲醇诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blotting对培养物上清进行分析。结果表明:成功构建了HLS2毕赤酵母真核表达载体pPIC9K-HLS2;经G418抗性梯度筛选获得了高拷贝菌株;电泳分析表明,培养上清中出现了与预测分子大小一致的49KDa左右的目的蛋白,且具有良好的免疫活性。本研究获得的大量HLS2蛋白,解决了抗蜱疫苗的抗原来源问题,为抗长角血蜱疫苗的深入研究奠定了基础。运用DNAStar分子生物学软件,对HLS2蛋白的二级结构及其抗原表位进行了识别分析和预测,结果表明HLS2编码蛋白有较高的抗原指数、较多的抗原表位,这与HLS2编码蛋白具有良好的抗原性相一致;HLS2编码蛋白的N-糖基化位点分析表明,含有三个潜在的N-糖基化位点;为深入研究HLS2编码蛋白的结构和功能提供理论参考,也为以抗原表位为基础的疫苗设计提供指导和借鉴。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1 丝氨酸蛋白酶抑制剂的概述
• 2 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的分布
• 2.1 寄生虫中的丝氨酸蛋白酶抑制剂
• 2.2 其他物种中的丝氨酸蛋白酶抑制剂
• 3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构与功能
• 4 丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用机理
• 5 丝氨酸蛋白酶抑制剂的应用前景
• 第二章 长角血蜱 HLS2 基因原核表达载体的构建及表达
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验动物及蜱
• 1.1.2 菌种、载体
• 1.1.3 酶和主要试剂
• 1.1.4 主要仪器、设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 表达引物的设计
• 1.2.2 长角血蜱总RNA 的提取
• 1.2.3 RT-PCR 扩增
• 1.2.4 RT- PCR 产物的回收与纯化
• 1.2.5 目的片段与pET-30a（+）载体的酶切回收
• 1.2.6 目的片段与表达载体的连接
• 1.2.7 JM109 感受态细胞的制备
• 1.2.8 连接产物的转化
• 1.2.9 重组质粒的提取与鉴定
• 1.2.10 表达菌株的获得
• 1.2.11 重组质粒的诱导表达
• 1.2.12 表达产物的SDS-PAGE 检测
• 1.2.13 融合蛋白表达形式的鉴定
• 1.2.14 重组蛋白的纯化
• 1.2.15 表达产物的Western-blotting 检测
• 2 结果
• 2.1 长角血蜱总RNA 检测结果
• 2.2 目的基因 HLS2 的 RT-PCR 扩增结果
• 2.3 重组表达质粒 pET-30a-HLS2 的鉴定
• 2.4 重组质粒的测序结果及序列分析
• 2.5 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 2.6 Western blotting 分析
• 3 讨论
• 第三章 长角血蜱 HLS2 在毕赤酵母中的表达
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 蜱种、菌种和载体
• 1.1.2 酶和主要试剂
• 1.1.3 培养基和溶液
• 1.1.4 主要仪器、设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 酵母表达载体的构建
• 1.2.2 重组表达载体 pPIC9K-HLS2 的线性化
• 1.2.3 毕赤酵母感受态细胞的制备
• 1.2.4 电转化
• 1.2.5 重组酵母菌株的筛选鉴定
• 1.2.6 重组菌株的诱导表达
• 1.2.7 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测
• 2 结果
• 2.1 HLS2 基因的 PCR 扩增
• 2.2 重组表达载体 pPIC9K-HLS2 的构建及鉴定
• 2.2.1 重组表达载体 pPIC9K-HLS2 的构建
• 2.2.2 重组表达载体 pPIC9K-HLS2 的鉴定
• 2.3 重组表达载体 pPIC9K-HLS2 的线性化
• 2.4 重组酵母菌株的筛选鉴定
• 2.4.1 影印接种法筛选G418 抗性菌株结果
• 2.4.2 重组酵母菌株的PCR 鉴定结果
• 2.5 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 2.6 表达产物的Western-blotting 检测
• 3 讨论
• 第四章 HLS2 基因编码蛋白的结构预测
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 长角血蜱 HLS2 基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
• 2.2 HLS2 基因编码蛋白二级结构和淋巴细胞表位的预测
• 2.2.1 HLS2 基因编码蛋白二级结构的预测
• 2.2.2 HLS2 基因编码蛋白抗原特异性淋巴细胞抗原表位的预测
• 2.3 HLS2 基因编码蛋白糖基化位点的预测
• 3 讨论
• 第五章 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介