发光细菌法检测抗生素及砷敏感型发光细菌表达载体构建

论文摘要

本研究应用发光细菌检测单一抗生素生物毒性及多种抗生素之间的联合毒性作用，以期建立一种多元抗生素联合生物毒性的快速评价方法。以HgCl2为毒性参照，采用等毒性配比法研究了饲用盐酸金霉素、吉他霉素、盐霉素和黄霉素对发光细菌的联合毒性。结果表明：盐酸金霉素、吉他霉素、盐霉素、黄霉素对明亮发光杆菌的急性毒性EC50分别为9.21、146.13、4.24和134.68mg/L，发光细菌的相对发光强度（RLU）随着抗生素浓度的提高而降低，并分别在216mg/L、25200mg/L、18mg/L和25200mg/L范围内呈良好线性关系。多元饲用抗生素对发光细菌具有联合毒性的作用：吉他霉素与盐酸金霉素、盐霉素和黄霉素三种抗生素的二元组合对发光细菌的联合毒性表现为较强的协同作用；盐酸金霉素、盐霉素和黄霉素两两分别组合对发光细菌的联合毒性表现为拮抗作用；三元及四元抗生素混合体系对发光细菌的联合毒性均表现为拮抗作用。采用聚合酶链式反应（PCR）从明亮发光杆菌基因组中扩增得到荧光素酶基因LuxAB，从大肠杆菌DH5α基因组中扩增得到重金属砷的特异性启动子O/P-arsR，连接至大肠杆菌高效表达载体pET-32a，并使砷抗性启动子位于荧光素酶基因上游，构建了细菌荧光素酶砷离子诱导表达载体pET32a-luxAB-arsR。以大肠杆菌BL21为宿主菌，采用化学转化法将表达载体pET32a-luxAB-arsR转化大肠杆菌BL21，以IPTG、不同形态砷诱导表达重组表达载体，成功表达ArsR砷抗操纵子转录阻遏蛋白和明亮发光杆菌荧光素酶，且重组表达载体经Hg2+、Cd2+、Pb2+诱导，arsR基因和LuxAB基因均未表达，成功构建了砷敏感型重组发光细菌表达载体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一章 绪论
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 发光细菌法研究进展
• 1.2.1 发光细菌法
• 1.2.2 发光细菌荧光素酶基因
• 1.2.3 细菌抗砷机制
• 1.2.4 特异性基因工程菌株
• 1.2.5 小结
• 1.3 研究内容及方法
• 1.3.1 研究内容
• 1.3.2 研究方法
• 第二章 试验研究
• 试验一 应用发光细菌法对饲用抗生素单一及联合毒性的研究
• 摘要
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 仪器
• 2.2.2 菌种和试剂
• 2.2.3 方法
• 2.3 结果分析
• 2对明亮发光杆菌的急性毒性'>2.3.1 HgCl₂对明亮发光杆菌的急性毒性
• 2.3.2 一元抗生素对发光细菌的急性毒性
• 2.3.3 二元抗生素对发光细菌的联合毒性
• 2.3.4 多元抗生素对发光细菌的联合毒性
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 试验二 砷敏感型发光细菌基因工程菌表达载体的构建
• 摘要
• 2.1 前言
• 2.2 材料、试剂与仪器
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 明亮发光杆菌和大肠杆菌 DH5α的复苏及扩大培养
• 2.3.2 luxAB 和 O/P-arsR 基因的克隆
• 2.3.3 pET32a-luxAB-arsR 表达载体的构建
• 2.3.4 重组基因工程菌的诱导表达
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 luxAB 和 O/P-arsR 基因的克隆电泳结果
• 2.4.2 pET32a-luxAB-arsR 表达载体的构建电泳结果
• 2.4.3 砷敏感型基因工程菌诱导表达 SDS-PAGE 电泳结果
• 2.5 讨论
• 2.5.1 不同砷形态化合物作为诱导物对目的蛋白表达量的影响
• 2.5.2 不同诱导时间对目的蛋白表达量的影响
• 2.5.3 重组工程菌的砷敏感性检测
• 2.6 小结
• 第三章 结论
• 3.1 主要结论
• 3.2 有待进一步研究的问题
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历