论文摘要
沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）是目前国内外最常见的性病病原体之一，也是非淋球菌性尿道炎（Non-Gonococcal Urethritis，NGU）的主要病原体。泌尿生殖道Ct感染的发病率在我国有逐年增加的趋势，耐药性日益严重，已成为危害公共健康的一大问题。噬菌体（bacteriophage；phage）是一群能特异地感染宿主细菌并将其裂解的病毒，它不仅在分子生物学研究中起重要作用，作为抗菌剂治疗细菌感染正日益受到重视。衣原体噬菌体是微病毒，目前只是在肺炎衣原体、感染流产衣原体、鱼类衣原体等数种衣原体种发现有噬菌体的存在，研究显示组成衣原体噬菌体壳的衣壳蛋白主要成分是Vp1、Vp2和Vp3，其中Vp1是最主要的结构蛋白，这三种蛋白在噬菌体对衣原体的黏附和殖入中可能有重要作用。同时该蛋白高度保守而特异，因而是在其它衣原体种——尤其是沙眼衣原体寻找衣原体噬菌体的良好标志物。本课题旨在对Vp1蛋白进行分离和纯化，为下一步研究该蛋白的免疫原性、Vp1蛋白单克隆抗体制备及Vp1蛋白与衣原体作用的相关机制奠定基础。并通过纯化的Vp1蛋白和由此得到的Vp1抗体进行临床筛查，试图发现沙眼衣原体噬菌体——其潜在的临床价值令人期待。目的：对衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白VP1蛋白进行表达、纯化和鉴定。方法：将带有vp1基因—pET30a（+）的大肠杆菌BL21进行卡那霉素抗生素平板筛选后，挑取生长的单菌落培养至对数生长期并提取重组质粒，限制性核酸内切酶BamHI单酶切，1％琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。重组质粒长度与理论长度相近后，重组质粒测序，应用核酸分析软件（Gene runner）比对vp1基因测序结果和Genebank提供的vp1基因序列（GeneID：1261929）的同源性。IPTG诱导上述大肠杆菌BL21表达融合蛋白。细菌裂解物离心的上清和沉淀分别行SDS-PAGE电泳，分析融合蛋白的表达形式。不溶性（包涵体）表达的融合蛋白带有组氨酸标签，以抗组氨酸标签抗体（Histag antibody）为一抗，Western blot技术鉴定融合蛋白。优化IPTG浓度和诱导时间后大量表达蛋白，以含6M脲的结合缓冲液（binding buffer）溶解细菌裂解物离心沉淀，经0.45um孔径滤器过滤后上纯化柱（His-Bind column）结合，按变性条件下洗脱步骤分步洗脱并优化洗脱条件，SDS-PAGE电泳分析洗脱样品。收集电泳条带单一的洗脱样品透析复性，考马斯亮蓝法对蛋白进行定量。并以Vp1多克隆抗体为一抗，Western blot方法鉴定Vp1蛋白的抗原性。结果：单酶切重组质粒可见在约8000bp处有单一DNA条带，质粒测序后比对结果示同源性为99.46％，为同义突变，氨基酸序列同源性为100％，重组质粒构建正确。经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和Western Blot显示从细菌裂解物离心沉淀中能获得约70kD的衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp1，细菌裂解物上清电泳未发现目的蛋白。诱导条件优化后，证实采取37℃、0.03mM IPTG及诱导2小时为最适诱导条件。6M脲的结合缓冲液能很好溶解离心沉淀，经0.45um孔径滤器过滤后溶液清亮，上柱后未出现堵塞现象。提纯过程中增加结合缓冲液（binding buffer）洗涤次数后，洗脱早期即得到单一蛋白电泳条带的洗脱样品。蛋白定量为126.3ug／ml。透析复性后以Vp1多克隆抗体为一抗Western blot鉴定示70KD处出现显色条带，从而显示获得的Vp1蛋白具有抗原性。结论：1、获得的vp1-pET30a（+）重组质粒构建正确。2、重组子经诱导后能够表达衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp1，该蛋白以包涵体形式存在于碎菌沉淀中。3、经提纯后，Vp1蛋白被初步分离成功。4、复性后的衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp1经Western blot鉴定具有抗原性。