“高热病”猪群中PRRSV流行株的研究

论文摘要

2006年国内暴发一种以高热、眼分泌物增多、食欲不振、便秘或腹泻、咳嗽、腹式呼吸和全身皮肤发红为主要症状的急性传染病。因最初病因没有明确定论,故把此次疫情定名为“猪高热病”或“猪无名高热”。为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在“猪高热病”中的地位;与以往的PRRSV相比,“高热病”猪群中流行的PRRSV的致病力究竟发生了怎样的变化,本研究对持续高热病猪体内的PRRSV流行株进行了分离、鉴定和基因克隆;分析了PRRSV流行株之间及其与国内外已发表的其它毒株间的遗传变异关系;进一步将所分离的PRRSV流行株研制成灭活疫苗对健康猪进行免疫并评估其免疫效果,为探索“高热病”猪群中PRRSV流行株的来源、分子流行病学特征提供科学依据,同时也为“猪高热病”的防治奠定理论基础。本研究的主要内容和结果如下: 1.将采自江西、湖南、河南、海南、广东、广西等6省的不同猪场持续发热的96头发病猪的血清、肺脏处理物、脾和淋巴结混合处理物共225份样品通过RT-PCR进行PRRSV检测,同时将这些样品处理后分别接到Marc-145细胞和肺泡巨嗜细胞（PAMs）上分离病毒。结果表明:发病猪感染PRRSV的总阳性率为37.5%;在Marc-145细胞上有53份样品分离到PRRSV,在PAMs上有48份样品分离到PRRSV,并通过RT-PCR方法确定所分离的PRRSV均为美洲型。说明“高热病”猪群中美洲型PRRSV的感染严重。2.通过RT-PCR分段扩增PRRSV流行株Jiangxi-3的基因组,参照VR2332序列,根据各片段之间相重叠的区域,将扩增片段的序列依次拼接获得Jiangxi-3完整的全基因组,并通过DNA star软件对其进行分析。结果表明:Jiangxi-3的Nsp2发生30个氨基酸的不连续缺失,与HB-1（sh） /2002相比,Nsp2的第480位氨基酸由D突变为E,缺失的位置为第481位氨基酸和532～560位氨基酸;Jiangxi-3与2006年从江西“高热病”病死猪体内分离的毒株JXA1的各个阅读框的氨基酸同源性为99.2%～100%;Jiangxi-3与HB-1（sh）/2002、VR2332、RespPRRS MLV的Nsp2的氨基酸同源性分别为98.5%、77.8%、77.7%,由遗传系统发育树可知与2006年以前分离的毒株相比,Jiangxi-3与HB-1（sh）/2002的亲缘关系较近。说明Jiangxi-3和JXA1极可能由同一毒株HB-1（sh）/2002演化而来。3.进一步将从江西、湖南、海南、广东等4省不同猪场的病猪体内分离的其它10株PRRSV流行株的Nsp2、ORF5和ORF3基因进行序列分析。结果表明:这10株病毒的Nsp2也发生30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与Jiangxi-3相同;Jiangxi-3和这10株流行株之间ORF5、ORF3基因的核苷酸分别为99.0%100.0%、99.0%～99.6%,推定的氨基酸同源性分别为98.0%100.0%、98.8%～99.6%;根据Nsp2所建立的遗传系统发育树可知这10株PRRSV流行株的亲缘关系很近。说明江西、湖南、海南、广东等4省的PRRSV流行株由同一毒株演化而来。4.为了便于检测“高热病”猪群中流行的PRRSV Nsp2缺失变异株,根据上述研究中PRRSV流行株Nsp2的缺失位置,设计合成能区分经典株和缺失株的特异性引物对E1/E2,经典株扩增片断为650 bp,而缺失株扩增片断为560 bp,运用正交法确定了最佳反应条件,建立了检测PRRSV Nsp2缺失变异株的RT-PCR方法,用该方法检测发现本研究中分离的毒株均为Nsp2缺失变异株。5.通过Reed-Muench法测得Jiangxi-3、Jiangxi-4、Hunan-1、Hunan-2 4株PRRSV Nsp2缺失株（第3代）的病毒滴度分别为103.75104.5 TCID50/mL。然后将毒株分别肌肉接种PRRSV和PCV2抗原与抗体均为阴性的健康猪,并各设同居试验猪。通过体温检测、临床症状和病理解剖观察、RT-PCR、ELISA、病理切片等方法分析其病毒致病性。结果表明:接种病毒猪和同居试验猪均表现为典型的猪繁殖与呼吸综合征临床症状,最后试验猪均死亡。试验猪解剖发现均出现以心叶、尖叶为主的灶性暗红色实变为特征的肺脏病变;病理切片也显示为典型的猪繁殖与呼吸综合征病理变化。由高度接触性的传染、明显的临床症状、发病到死亡的时间较短、典型的间质性肺炎和病毒性脑膜脑炎病理变化的出现,以及在脑组织能够检测到PRRSV核酸都说明这4株分离株PRRSV Nsp2缺失变异株的致病力增强。6.通过Reed-Muench法测得Jiangxi-3第9代病毒（简称Jiangxi-3 F9）的病毒滴度为105.25 TCID50/mL,并进一步测得Jiangxi-3 F9对6月龄猪的致病力也比较强。同时将毒株按10倍递减稀释法稀释成3个滴度,每个滴度分别接种3头60日龄的PRRSV和PCV2抗原与抗体均为阴性的健康猪,检测的Jiangxi-3 F9为102.2LD50/mL。将Jiangxi-3 F9按照参规方法研制成灭活疫苗,经肌肉注射途径免疫PRRSV和PCV2抗原与抗体均为阴性的60日龄健康猪,免疫剂量为每头2 mL,免疫组分别于初次免疫第21和28天、二次免疫第28天（即初次免疫第28天加强免疫1次）用200LD50的Jiangxi-3 F9进行攻毒,同时各组均设立对照组。通过试验动物的体温变化、临床症状、血清中PRRSV的抗体和抗原的定期检测结果来评价灭活疫苗的免疫效果。结果表明:初次免疫第21天和28天的免疫组攻毒后体温仍然明显升高,而二次免疫第28天的免疫组攻毒后体温升高不明显,最高体温在40℃附近。初次免疫21 d～28 d免疫组特异性抗体水平持续升高,初次免疫第28天产生的抗体与初次免疫第21天产生的抗体差异显著（0.01<P<0.05）;二次免疫后免疫组抗体水平仍持续升高,第28天可达3.105±0.125,二次免疫第28天产生的抗体与初次免疫28天产生的抗体差异显著（0.01<P<0.05）。初次免疫第21天和第28天免疫组攻毒后仍能在血清中检出PRRSV抗原,仍有不同程度的临床症状,而二免第28天的免疫组攻毒后其PRRSV抗原检出率、发病率、死亡率均为0。说明对健康猪而言初次免疫第28天加强免疫一次比免疫一次效果好。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 猪繁殖与呼吸综合征及其病原的研究进展
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的起源和分类
• 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒生物学特性
• 1.2.1 病毒的形态特征
• 1.2.2 病毒的侵入和释放
• 1.2.3 病毒的培养特性
• 1.2.4 病毒的抵抗力
• 1.2.5 病毒的血凝特性
• 1.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究
• 1.3.1 病毒的基因组结构与特点
• 1.3.2 病毒基因组编码的蛋白的结构和功能
• 1.3.3 病毒的复制特点
• 1.3.4 PRRSV 的分子遗传变异
• 1.4.P RRSV 的流行病学研究
• 1.4.1 宿主因素
• 1.4.2 病毒因素
• 1.4.3 疫苗因素
• 1.4.4 饲养管理与环境因素的影响
• 1.5 PRRS 的临床症状
• 1.6 PRRS 发生后猪的组织病理学变化
• 1.6.1 胎儿、新生仔猪
• 1.6.2 哺乳仔猪
• 1.6.3 母猪
• 1.7 诊断研究
• 1.7.1 病毒分离
• 1.7.2 抗原检测
• 1.7.3 血清学试验检测抗体
• 1.7.4 分子生物学检测方法
• 1.8 免疫学研究
• 1.8.1 感染免疫反应
• 1.8.2 对免疫细胞的影响
• 1.8.3 体液免疫
• 1.8.4 细胞免疫
• 1.8.5 细胞因子的产生
• 1.8.6 抗体依赖性增强作用
• 1.9 PRRSV 与其他病原体的相互作用
• 1.10 疫苗免疫及防制策略
• 第二章 2006 年“猪高热病”的概况
• 2.1 “猪高热病”概况
• 2.1.1 2006 年“猪高热病”病情进展
• 2.1.2 “猪高热病”的流行病学调查
• 2.1.3 “高热病”病猪主要临床症状
• 2.1.4 “高热病”病猪剖检病变
• 2.1.5 “猪高热病”流行的诱因
• 2.1.6 “猪高热病”造成的负面影响
• 2.1.7 “猪高热病”的诊断和治疗
• 2.2 “猪高热病”病原研究进展
• 第三章 “高热病”猪群中PRRSV 的调查与其流行毒株的分离
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 主要试验仪器
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 细胞与阳性对照病毒株
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 培养基的配制
• 3.2.2 引物设计
• 3.2.3 病例与猪群的调查
• 3.2.4 病料的采集及处理
• 3.2.5 血清中PRRSV 抗体的检测
• 3.2.6 病料中PRRSV 的检测
• 3.2.7 细胞培养
• 3.2.8 病毒分离
• 3.3 结果
• 3.3.1 血清样品中PRRSV 抗体的检测
• 3.3.2 病料样品中PRRSV RT-PCR 结果
• 3.3.3 病毒分离
• 3.4 讨论
• 第四章 PRRSV 流行株JIANGXI-3 的全基因组序列分析
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 主要仪器
• 4.1.2 试剂和耗材
• 4.1.3 毒株、菌种和质粒
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 培养基的配制
• 4.2.2 引物设计
• 4.2.3 病毒RNA 的提取
• 4.2.4 各段基因的扩增
• 4.2.5 RT-PCR 产物的鉴定
• 4.2.6 纯化回收CDNA 片段
• 4.2.7 纯化产物与PMD 18-T VECTOR 连接
• 4.2.8 感受态细胞的制备（CACL2 法）
• 4.2.9 连接产物的转化
• 4.2.10 重组质粒的提取
• 4.2.11 重组质粒的鉴定
• 4.2.12 重组质粒的测序分析
• 4.2.13 本研究分离毒株全基因组序列变异分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 全基因组多个片断的扩增及阳性克隆鉴定
• 4.3.2 序列测定与分析
• 4.4 讨论
• 第五章 PRRSV 流行株NSP2、ORF5、ORF3 基因的序列分析
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 毒株、菌种和质粒
• 5.1.2 试剂和耗材
• 5.1.3 主要仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 引物设计
• 5.2.2 病毒的增殖
• 5.2.3 病毒RNA 的提取
• 5.2.4 RT-PCR
• 5.2.5 RT-PCR 产物的鉴定
• 5.2.6 纯化回收CDNA 片段
• 5.2.7 纯化产物与PMD 18-T VECTOR 连接
• 5.2.8 感受态细胞的制备（CACL2 法）
• 5.2.9 连接产物的转化
• 5.2.10 重组质粒的提取
• 5.2.11 重组质粒的鉴定
• 5.2.12 分离毒株ORF3、ORF5、NSP2 序列分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 病毒的增殖
• 5.3.2 ORF3、NSP2 和ORF5 基因的克隆测序
• 5.3.3 NSP2 基因变异缺失区序列分析
• 5.3.4 所测毒株ORF5 基因的同源性分析
• 5.3.5 ORF3 基因序列分析
• 5.4 讨论
• 第六章 上述PRRSV NSP2 缺失株检测方法的建立
• 6.1 试验材料
• 6.1.1 细胞及毒株
• 6.1.2 主要试剂
• 6.1.3 主要仪器
• 6.2 试验方法
• 6.2.1 引物设计
• 6.2.2 病毒RNA 的制备
• 6.2.3 RT-PCR 扩增
• 6.2.4 特异性试验
• 6.2.5 敏感性试验
• 6.2.6 灵敏度试验
• 6.3 结果
• 6.3.1 PCR 扩增条件的优化
• 6.3.2 特异性试验
• 6.3.3 敏感性试验
• 6.3.4 灵敏度试验
• 6.4 讨论
• 第七章 猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的致病性试验
• 7.1 试验材料
• 7.1.1 毒株
• 7.1.2 试剂
• 7.1.3 试验动物
• 7.2 试验方法
• 7.2.1 病毒增殖
• 50 的测定'>7.2.2 病毒TCID₅₀的测定
• 7.2.3 致病性试验
• 7.3 结果
• 7.3.1 病毒的增殖
• 50 测定'>7.3.2 TCID₅₀测定
• 7.3.3 致病性试验
• 7.4 讨论
• 第八章 PRRSV 流行株JIANGXI-3 灭活疫苗的效果评价
• 8.1 试验材料
• 8.1.1 毒株
• 8.1.2 试剂
• 8.1.3 试验动物
• 8.2 试验方法
• 8.2.1 病毒增殖
• 50 的测定'>8.2.2 病毒TCID₅₀的测定
• 8.2.3 JIANGXI-3 毒株的6 月龄猪的攻毒试验
• 50 的测定'>8.2.4 JIANGXI-3 毒株的LD₅₀的测定
• 8.2.5 灭活疫苗的研制
• 8.2.6 灭活疫苗的效果评价
• 8.3 结果
• 50 测定'>8.3.1 JIANGXI-3 9 代的TCID₅₀测定
• 8.3.2 6 月龄猪试验结果
• 50 试验的结果'>8.3.3 LD₅₀试验的结果
• 50 试验后存活猪的再次攻毒试验结果'>8.3.4 LD₅₀试验后存活猪的再次攻毒试验结果
• 8.3.5 灭活疫苗的免疫效果评价试验结果
• 8.4 讨论
• 8.4.1 临床症状
• 8.4.2 解剖病变和病理变化
• 8.4.3 抗原的变化
• 8.4.4 抗体的变化
• 结论
• 参考文献
• 附录1 动物试验部分照片
• 附录2 部分毒株的基因登录结果
• 致谢
• 作者简介